多浪羊雙肌臀基因Callipyge序列分析

方翟 范文斌 高慶華

摘要：綿羊的雙肌臀（Callipyge）基因表現(xiàn)型為后臀肌肉增大近30%，由位于綿羊第18號常染色體上基因上游存在一個N→ C的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記（命名為SNPCLPG）產(chǎn)生的，該SNP標(biāo)記的存在與Callipyge表現(xiàn)完全吻合。為此，根據(jù)已知多態(tài)性，選擇設(shè)計合成了1對引物，以多浪羊為研究對象，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，進(jìn)行了SNPCLPG位點的檢測。獲得303 bp的擴(kuò)增片斷，測序后進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在38 bp處堿基產(chǎn)生A到G的突變，在80、92、149、219 bp處堿基產(chǎn)生T到C的突變。

關(guān)鍵詞：多浪羊;PCR;雙肌臀;突變

中圖分類號：S826 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：1007-273X（2019）07-0005-03

多浪羊是新疆特有的一個優(yōu)良的肉脂兼用型綿羊品種，因其中心產(chǎn)區(qū)在麥蓋提縣，故又稱麥蓋提羊。多浪羊體格大、產(chǎn)肉多、肉質(zhì)鮮嫩、性成熟早、繁殖率高、遺傳性能穩(wěn)定。大部分母羊可達(dá)到兩年三產(chǎn)，雙羔率達(dá)30%～40%，4～5月齡羔羊體重可達(dá)35 kg;育肥性能好，育肥羊屠宰率可達(dá)55%以上，是組織羔羊肉生產(chǎn)的理想品種。

在綿羊的品種改良中，培育產(chǎn)肉量高、肉質(zhì)好、嫩度高的綿羊品種一直是育種工作者不懈的追求，通過傳統(tǒng)的遺傳改良和營養(yǎng)調(diào)控手段來提高動物的瘦肉率和肌肉品質(zhì)已很難再有大的進(jìn)展。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和動物基因組研究的深入開展，加快了對綿羊雙肌（Callipyge）性狀更進(jìn)一步的研究。

研究發(fā)現(xiàn)該性狀是由于18號常染色體上的一個野生型等位基因（N）發(fā)生突變所致，而且該突變基因以非孟德爾方式遺傳[1]。目前試驗已證實了Callipyge突變基因以極性超顯性的方式遺傳。一般用C（代表突變基因Callipyge）、N（代表正常野生型基因）控制雙肌性狀的這一對等位基因，組成4種基因型（CC、CN、NC和NN），但僅有從父本中獲得CN基因型的雜合子公羊才表現(xiàn)出雙肌臀性狀，其他3種基因型個體都表現(xiàn)正常。

Callipyge 的遺傳效應(yīng)在肉用型、毛用型和多胎型等得到了廣泛的研究，其中最顯著的就是提高雙肌臀羊的瘦肉率這一遺傳效應(yīng)，Callipyge基因使雙肌臀羊腰部和腿部的肌肉過度發(fā)育而顯著增大;同時，該基因還能使皮下、肌間、肌內(nèi)和腎臟周圍的脂肪減少，進(jìn)而間接地增加了綿羊的瘦肉率。Freking等[2]的研究都證明了這一觀點，這和動物生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)利益相關(guān)性最強(qiáng)。此外，Callipyge基因還對屠宰率、飼料利用率、胴體性狀等產(chǎn)生一定的影響。

本研究采集多浪羊血液樣本，設(shè)計引物，擴(kuò)增CalliPyge基因，旨在驗證多浪羊Callipyge基因是否存在突變。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品 ?在塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實驗站隨機(jī)選取23只多浪羊母羊，用10 mL的真空采血管（檸檬酸鈉抗凝）頸靜脈采血5 mL，放置在冰盒內(nèi)帶回實驗室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ?PCR引物設(shè)計 ?CalliPyge基因引物參照Freking[2]等在GenBank中發(fā)表的包括CLPGSNP位點的DNA序列（登錄號：AF401294）設(shè)計引物，長度為303 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物Calli-F：5′-CAGCAGCAGAGCAG

AGAAC-3′;下游引物Calli-R：5′-AAATTGGAAGGC

TTGGAGGT-3′。

1.1.3 ?主要試劑 ?血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit、離心柱型）（購自天根生化科技有限公司）、超純水、EB、Marker，Buffer、5倍TAE（Tris 12.1 g、EDTA 1.86 g、醋酸2.855 mL，蒸餾水加至500 mL）。

1.1.4 ?主要儀器與設(shè)備 ?主要儀器與設(shè)備名稱見表1。

1.2 ?方法

PCR擴(kuò)增體系見表2。按照預(yù)試驗所得最適退火溫度為57 ℃， PCR反應(yīng)優(yōu)化條件為：94 ℃預(yù)變性4 min→94 ℃ 變性30 s→57 ℃ 退火30 s→72 ℃ 延伸1 min→72 ℃延伸10 min→于4 ℃保存，共進(jìn)行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將檢驗合格的PCR產(chǎn)物編號，放置于有冰袋的泡沫箱中，密封，寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司，雙通測序。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?DNA提取結(jié)果

利用試劑盒提取多浪羊血液DNA，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物條帶單一，是所需要的目的條帶（圖1）。

2.2 ?PCR擴(kuò)增結(jié)果

對Callipyge基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物條帶單一，大小稍大于300 bp，與目的片段長度303 bp大小一致（圖2）。

2.3 ?測序結(jié)果

2.3.1 ?直接測序結(jié)果 ?生工生物工程（上海）股份有限公司的測序結(jié)果為303 bp，與目的片段長度303 bp符合。利用Chromas軟件將測序結(jié)果導(dǎo)出，其中部分測序結(jié)果見圖3。

2.3.2 ?堿基數(shù)目分析 ?通過對23個樣品進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，堿基A占28.12%，堿基T占29.85%，堿基C占24.54%，堿基G占17.49%。其中C+G含量占42.03%，A+T含量占57.97%，A+T含量遠(yuǎn)高于C+G的含量。

2.3.3 ?突變分析 ?用NDAMAN分析，Identity=99.79%，在38 bp處堿基A突變?yōu)镚，在80、92、149、219 bp處堿基T突變?yōu)镃（圖4）。

3 ?討論

多浪羊個體大、生長發(fā)育快、早熟性好，有寶貴的多胎性和繁殖率高、采食能力強(qiáng)、飼料報酬高、產(chǎn)肉性能好、肉質(zhì)鮮美可口、被毛絨毛多、毛質(zhì)較好、性情溫順、遺傳性穩(wěn)定等特點，廣受養(yǎng)殖戶的喜愛。Callipyge基因可有效提高綿羊的瘦肉率、屠宰率和飼料利用率等性能。本研究檢測了雙肌臀基因在多浪羊上的表達(dá)，尋找其突變位點。王海亮等[3]研究發(fā)現(xiàn)第184 bp處C突變?yōu)門，證明可能與山羊雙肌性狀有關(guān)。劉曉敏等[4]對歐拉型藏羊Callipyge基因多態(tài)性與生長性狀相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在176 bp處有N到C的突變。李云龍等[5]對寧夏回族自治區(qū)賀蘭和鹽池縣分別采集87頭灘羊、73頭特克塞爾羊、70頭薩?？搜蚝?12頭無角陶賽特羊的血樣研究后發(fā)現(xiàn)，在四個綿羊品種中沒有檢測到?jīng)Q定Callipyge表型的A→G單堿基突變，但在該位點上游35 bp處檢測到一個C→T的突變。

4 ?結(jié)論

本研究通過從多浪羊的血樣中提取DNA，將提取到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，測序后利用DNAstar比對分析，在38 bp處堿基產(chǎn)生A到G的突變，在80、92、149、219 bp處堿基產(chǎn)生T到C的突變。

參考文獻(xiàn)：

[1] YEN M Y，LIU Y C，WANG J H，et al.Streptococcus suis meningitis compli-cated with permanent perceptive deafness：report of a case[J]，F(xiàn)ormos Med Assoc，1994，93（4）：349-351

[2] FREKING B A，KEELE J W，BEATTIE C W，et al. Evaluation of the ovine callipyge locus：I. Relative chromosomal position and gene action.[J].Journal of animal science，1998，76（8）：2062-2071.

[3] 王海亮，李祥龍，周榮艷，等.山羊Callipyge基因型的檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007（11）：49-51.

[4] 劉曉敏，張利平，楊 ?聯(lián)，等.歐拉型藏羊Callipyge基因多態(tài)性與生長性狀相關(guān)性研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010（4）：1-4，9.

[5] 李云龍，楊章平，毛永江，等.綿羊Callipyge基因概述[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2008（2）：31-34.