植物乳桿菌YW11殺菌型發(fā)酵乳調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)

郝曉娜，羅天淇，張 健，趙 笑，余志堅，曹永強(qiáng)，楊貞耐,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

人體胃腸道內(nèi)寄居著種類繁多的微生物，腸道菌群能幫助宿主消化吸收食物中的營養(yǎng)物質(zhì)，并代謝宿主腸道中產(chǎn)生的有毒廢物，同時產(chǎn)生人體必需的氨基酸、維生素、短鏈脂肪酸等功能物質(zhì)為宿主所用。腸道菌群被認(rèn)為是調(diào)節(jié)宿主新陳代謝和免疫系統(tǒng)的“器官”[1]。越來越多的研究證明腸道菌群對人體的健康和生活起著復(fù)雜且至關(guān)重要的作用。許多研究表明腸道菌群與代謝綜合征、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）和結(jié)直腸癌等疾病有著密不可分的關(guān)系[2-3]。IBD是一種慢性易復(fù)發(fā)的腸道疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD）。

世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織專家組認(rèn)為，攝入足量的益生菌有益于人體的健康，關(guān)注最多的是益生性乳酸菌，如乳桿菌和雙歧桿菌[4]。乳酸菌的腸道調(diào)節(jié)作用被認(rèn)為歸因于有益腸道細(xì)菌的增加和有害細(xì)菌的減少[5]，并且由有害細(xì)菌的增殖引起的腹瀉可通過攝入含有乳酸菌的酸乳來緩解[6]。發(fā)酵乳被認(rèn)為是益生菌的良好載體。Granata等[7]發(fā)現(xiàn)攝入含有鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵制品能顯著增加老年人腸道中乳桿菌的數(shù)量。?zcan等[8]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳能顯著増加人體腸道乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，提高健康人群總厭氧菌中雙歧桿菌的比例，顯著降低有害產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量。孫建華等[9]研究表明雙歧桿菌BB12活菌型發(fā)酵乳能促進(jìn)雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，降低腸桿菌和腸球菌的數(shù)量。發(fā)酵乳不僅可以增加腸道內(nèi)乳桿菌的數(shù)量，而且可以在一定程度上促進(jìn)小鼠排便[10]。發(fā)酵乳能提高便秘小鼠的腸道推進(jìn)率，有效地改善便秘問題[11]。

關(guān)于活菌型發(fā)酵乳對腸道菌群的作用研究比較多，但是對巴氏殺菌發(fā)酵乳的研究相對較少。作為具有良好益生特性的植物乳桿菌菌株，當(dāng)被用于發(fā)酵牛乳飲料生產(chǎn)時，它不僅顯示出在產(chǎn)品中的高存活率，而且攝入后具有對胃酸和膽汁酸的良好耐受性，能抑制腸道有害細(xì)菌的增殖，有助于腸道菌群的平衡[12]。本實(shí)驗(yàn)研究具有耐酸性、耐膽鹽、降低膽固醇作用[13]的益生性植物乳桿菌YW11發(fā)酵液對常見病原菌的抑制作用，并將該菌株作為發(fā)酵劑應(yīng)用于巴氏殺菌發(fā)酵乳的制備，通過體外模擬人體消化模型，與人體糞便共培養(yǎng)，考察巴氏殺菌發(fā)酵乳對人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為益生性巴氏殺菌發(fā)酵乳的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌YW11分離于西藏靈菇樣品，乳雙歧桿菌由北京工商大學(xué)乳制品實(shí)驗(yàn)室保藏。沙門氏菌22956、福氏志賀氏菌21534、阪崎腸桿菌21544、動物雙歧桿菌21709 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；李斯特氏菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌CMCC26071、大腸桿菌CMCC44825 廣東微生物菌種保藏中心。

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、PTYG培養(yǎng)基、BCM培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA提取試劑盒 美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

705型－80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Electron公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；BCN-1360B超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HZQ-Q恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；U-3900紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌YW11抑菌作用的測定

指示菌的活化：將沙門氏菌22956、福氏志賀氏菌21534、阪崎腸桿菌21544、大腸桿菌CMCC44825以體積分?jǐn)?shù)3%接種在LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。將李斯特氏菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌CMCC26071以體積分?jǐn)?shù)3%分別接種在BHI培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。將動物雙歧桿菌21709以體積分?jǐn)?shù)3%的接種在PTYG培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h?；罨瘍纱髠溆?。

植物乳桿菌YW11上清液制備：植物乳桿菌YW11在MRS液體培養(yǎng)基中活化兩代后，5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm無菌濾膜備用。

植物乳桿菌抑菌活性的測定：根據(jù)Dasari等[14]的方法稍作修改。向96 孔板中加入100 μL的LB、BHI、PTYG、肉湯培養(yǎng)基，取活化的指示菌，以體積分?jǐn)?shù)3%接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基中。取100 μL菌株YW11上清液加入到96 孔板中，對照組加入100 μL MRS培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h，在600 nm下測定吸光度。抑菌率的計算見公式（1）。

式中：A0為對照組的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

1.3.2 巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群的影響

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分組如表1所示。

表1 巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群影響的實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Experimental grouping and sampling schemes

1.3.2.2 巴氏殺菌發(fā)酵乳的制備

植物乳桿菌YW11按照體積分?jǐn)?shù)3%接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h活化兩代后備用。

全脂乳預(yù)熱至60～75 ℃，40 MPa下均質(zhì)，95 ℃殺菌5 min，冷卻至42 ℃并按體積分?jǐn)?shù)5%將活化兩代后的植物乳桿菌YW11接入全脂乳中，于42 ℃下發(fā)酵至pH 4.5，迅速置于68～70 ℃水浴鍋中，并保持此溫度30 min后急速冷卻到4 ℃，制成巴氏殺菌發(fā)酵乳，樣品于4 ℃冷藏備用。

1.3.2.3 巴氏殺菌發(fā)酵乳的體外模型消化處理

采用Jin Yan等[15]的方法并稍作修改，10 mL的巴氏殺菌發(fā)酵乳與等體積的35 mmol/L NaCl溶液混合，用HCl調(diào)至pH 2.0，以胃蛋白酶與底物質(zhì)量比1∶100加入胃蛋白酶，37 ℃水解1 h。然后用NaOH溶液調(diào)至水解液pH 7.0，以胰蛋白酶與底物質(zhì)量比1∶100加入胰蛋白酶，37 ℃消化1 h制得消化后的樣品。

1.3.2.4 糞懸液的制備

于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天采集健康成人（2男1女，年齡20～28 歲）糞便，志愿者能夠提供14 d內(nèi)的體檢報告，無腸道和慢性代謝疾病，90 d內(nèi)未服用抗生素，正常飲食，無飲酒、中藥。往50 mL離心管中預(yù)先加入20 mL PBS，稱質(zhì)量并記錄。迅速挖采足夠的中段糞便樣品（至少15 g）放入離心管中，漩渦振蕩混勻后稱質(zhì)量，用質(zhì)量差法計算需要再添加的PBS質(zhì)量，糞懸液終體積分?jǐn)?shù)為20%。在厭氧工作站中添加PBS，用兩層紗布濾去大顆粒殘渣，用小燒杯收集濾液，于2 h內(nèi)完成糞懸液的處理[16]。

1.3.2.5 巴氏殺菌發(fā)酵乳與健康人體糞便共培養(yǎng)

取消化后的樣品1 mL與0.5 mL的糞懸液混合，加入3.5 mL BCM培養(yǎng)基形成培養(yǎng)體系，將所有體系置于厭氧工作站，37 ℃恒溫，站內(nèi)氣體組成為體積分?jǐn)?shù)80% CO2、10% N2和10% H2，相對濕度75%，分別培養(yǎng)4、12 h取樣?？瞻捉M加入和樣品等體積的PBS。

1.3.2.6 16S rRNA測定菌群組成多樣性

選用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取培養(yǎng)物中的總DNA，并通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，同時采用紫外分光光度計對DNA進(jìn)行定量。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并采用AXYGEN凝膠回收試劑盒對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。使用Illumina MiSeq系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)測序，采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，以97%的序列相似度作為運(yùn)算分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分閾值，和NCBI進(jìn)行BLAST比較。

通過QIIME軟件分別對每個樣本計算Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Chao1指數(shù)（SChao1）通過計算群落中只檢測到1 次和2 次的OTU數(shù)目，估計群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，如式（2）所示計算。ACE指數(shù)（Sace）用來估計群落中含有OTU數(shù)，由Chao[17]提出，是生態(tài)學(xué)中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，如式（3）所示計算。Shannon指數(shù)（HShannon）包含物種和各種間個體分配的均勻性兩個部分，如式（4）所示計算。Simpson指數(shù)（DSimpson）為隨機(jī)抽取的兩個個體屬于不同種的概率，如式（5）所示計算。

式中：Sobs為實(shí)際測量出的OTU數(shù)；n1為只含有一條序列的OTU數(shù)；n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)。

式中：ni為含有i條序列的OTU數(shù)；Srare為含有不超過“abund”條序列的OTU數(shù)；Sabund為多于“abund”條序列的OTU數(shù)；abund為“優(yōu)勢”O(jiān)TU的閾值，默認(rèn)為10。

式中：Sobs為實(shí)際測量出的OTU數(shù)；ni為含有i條序列的OTU數(shù)；N為所有的序列數(shù)。

式中：Sobs為實(shí)際測量出的OTU數(shù)；ni為含有i條序列的OTU數(shù)；N為所有的序列數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌YW11發(fā)酵液的抑菌作用

益生菌對常見疾病的療效作用是微生物群落研究中最具有前景的領(lǐng)域之一。植物乳桿菌YW11發(fā)酵液對常見病原菌如沙門氏菌22956、福氏志賀氏菌21534、阪崎腸桿菌21544、李斯特氏菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌CMCC26071、大腸桿菌CMCC44825和益生菌雙歧桿菌的抑菌率分別為23.94%、10.81%、6.07%、34.18%、13.25%、3.33%、2.35%（圖1）。其中李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌屬厚壁菌門，大腸桿菌和沙門氏菌屬變形菌門。

圖1 植物乳桿菌YW11發(fā)酵液對常見病原菌和雙歧桿菌的抑菌作用Fig. 1 Inhibition rates of common pathogenic bacteria and Bifidobacteria by the fermenteation supernatant of L. plantarum YW11

據(jù)報道，沙門氏菌可引起慢性腸炎，多發(fā)生在幼兒和老年人群中。阪崎腸桿菌感染可引起小腸結(jié)腸炎，感染的大多數(shù)為嬰兒，特別是早產(chǎn)兒、出生體質(zhì)量偏低等身體狀況較差的新生兒。一旦感染李斯特氏菌，患者會出現(xiàn)發(fā)燒、肌肉疼痛、惡心、腹瀉等癥狀，但這種疾病不會迅速發(fā)病，具有一定的潛伏期。福氏志賀氏菌的菌毛能黏附于結(jié)腸黏膜的上皮細(xì)胞表面，繼而在侵襲蛋白作用下穿入上皮細(xì)胞內(nèi)；其產(chǎn)生的內(nèi)毒素能作用于腸壁，破壞黏膜，形成炎癥、潰瘍，出現(xiàn)典型的膿血黏液便。金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生數(shù)種引起急性腸炎的蛋白質(zhì)和腸毒素，分為A、B、C1、C2、C3、D、E及F 8 種血清型，對腸道破壞性大。大腸桿菌在不致病的情況下與人體互利共生，它寄生在人體大腸和小腸里，不但不會給人們的身體健康帶來任何危害，反而可以幫助人體合成VK2，但在機(jī)體免疫降低、腸道缺乏刺激等特殊情況下會造成感染。某些大腸桿菌能侵入大腸、小腸黏膜，引起潰瘍甚至出血，血清型大腸桿菌可引起人類腹瀉。本研究植物乳桿菌YW11發(fā)酵液對上述病原菌均有不同程度的抑制作用，表明植物乳桿菌YW11發(fā)酵液對腸道菌群可能存在潛在的調(diào)節(jié)作用。YW11發(fā)酵液對動物雙歧桿菌也表現(xiàn)出抑制作用，可能的原因是動物雙歧桿菌為產(chǎn)酸性益生菌，植物乳桿菌發(fā)酵降低了培養(yǎng)體系中的pH值，對動物雙歧桿菌的生長有抑制作用。

2.2 巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群的影響

2.2.1 菌群α多樣性分析

圖2 巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群OTU數(shù)的影響Fig. 2 Rarefaction curves of operational taxonomic unit (OTU) number

通過對腸道菌群微生物進(jìn)行OTU劃分，并繪制稀釋曲線（圖2）。一方面，稀釋曲線越來越平緩，說明當(dāng)前測序的深度足以反映該樣品中所包含的物種的多樣性；另一方面，稀釋曲線可以反應(yīng)同一測序深度下不同樣品中物種的多樣性。由圖2可知，YW11組和對照組分別進(jìn)行體外糞便共培養(yǎng)4 h和12 h的稀釋曲線均高于空白組，說明相同的測序深度下，YW11組和對照組樣品中OTU數(shù)多于空白組，共培養(yǎng)12 h后市售巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群多樣性的改善作用略優(yōu)于YW11巴氏殺菌發(fā)酵乳。

評定腸道菌群α多樣性的指數(shù)有Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重于表示群落的豐富度，其值越大，群落的豐富度越高。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)綜合考慮群落的豐富度和均勻度，其值越大，群落的多樣性越高。從圖3可知，經(jīng)消化的植物乳桿菌巴氏殺菌發(fā)酵乳和市售巴氏殺菌發(fā)酵乳與人體糞便共培養(yǎng)4、12 h之后，樣品組Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)高于空白組，說明植物乳桿菌巴氏殺菌發(fā)酵乳和市售巴氏殺菌發(fā)酵乳能夠增加腸道菌群的豐富度。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)組間無顯著性差異（P＞0.05）。許多研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群多樣性的下降與IBD炎癥的產(chǎn)生密切相關(guān)[18]。因此，在一定程度上，巴氏殺菌發(fā)酵乳能通過增加腸道菌群的多樣性緩解IBD炎癥的癥狀。

圖3 巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群多樣性指數(shù)的影響Fig. 3 Effect of the pasteurized fermented milk on species diversity index of the intestinal flora

2.2.2 菌群的結(jié)構(gòu)分析

圖4 巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Classification and composition of bacterial populations at the phylum level

人類腸道中能夠檢測并明確的菌群很少，主要包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）四大類[19]。本實(shí)驗(yàn)對OTU在每個門的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果如圖4所示。厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門占總細(xì)菌數(shù)量的99.95%以上。每個樣品中厚壁菌門和擬桿菌門的總豐度無差異（P＞0.05），放線菌門和變形菌門的總豐度無差異（P＞0.05），說明巴氏殺菌發(fā)酵乳通過調(diào)節(jié)厚壁菌門和擬桿菌門、放線菌門和變形菌門內(nèi)部的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)腸道菌群。對照組和YW11組的發(fā)酵乳與糞便共培養(yǎng)4、12 h后，厚壁菌門的相對豐度增加，其中YW11組的增加率分別為24.94%、4.86%；變形菌門的相對豐度降低，其中YW11組的減少率分別為2.11%、7.32%。Frank等[20]研究結(jié)果顯示，在IBD患者的腸道中厚壁菌門的豐度減少，變形菌門的豐度增加。對照組和YW11組的發(fā)酵乳與糞便共培養(yǎng)4、12 h后，擬桿菌門的相對豐度減少，其中YW11組的減少率分別為18.27%、13.51%；放線菌門的相對豐度增加，其中YW11組的增加率分別為7.36%、3.03%。放線菌門中含有雙歧桿菌益生菌，其豐度增加有可能對人體的健康有益。厚壁菌門包括產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌屬和李斯特氏菌等致病菌，短鏈脂肪酸有利于抑制腸道中病原菌的生長，但李斯特氏菌是致病菌，所以，厚壁菌門豐度的增加并不能說明巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群存在有益的作用，只能說明巴氏殺菌發(fā)酵乳在門水平上調(diào)節(jié)了腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

2.2.3 YW11巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群組成的影響

為了研究巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群在屬水平上的調(diào)節(jié)作用，本研究對聚類到每個屬的菌群進(jìn)行了統(tǒng)計分析。從圖5可以看到，對照組和YW11組主要增加了高豐度菌落的豐度，但是這種影響的利弊無法解釋，因此對每個門中含有的高豐度菌屬及常見菌屬進(jìn)行統(tǒng)計分析。

圖5 巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Classification and composition of bacterial populations at the genus level

2.2.3.1 厚壁菌門中菌群的組成

厚壁菌門中毛螺旋菌屬（Lachnospira）、罕見小球菌屬（Subdoligranulum）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和布勞特氏菌屬（Blautia）可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸。其中，毛螺旋菌、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬可產(chǎn)生丁酸[21]，丁酸鹽是結(jié)腸上皮最好的氧化底物，占結(jié)腸細(xì)胞氧耗量的80%[22]；丁酸鹽還能通過降低環(huán)氧合酶、過氧化物酶的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制組蛋白去乙酰化及核因子κB活化，保護(hù)腸黏膜屏障[23]。丁酸水平降低參與了IBD炎癥的起始和加重過程[24]。Rehman等[25]研究發(fā)現(xiàn)CD患者腸道中毛螺旋菌屬、羅斯氏菌屬、瘤胃球菌屬和布勞特氏菌屬的含量減少。從圖6可知，YW11組相比空白組，在與糞便共培養(yǎng)4 h后，毛螺旋菌屬、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬的相對豐度增加率分別為3.00%、0.55%、0.33%；在與糞便共培養(yǎng)12 h后，毛螺旋菌屬、羅斯氏菌屬和瘤胃球菌屬的相對豐度增加率分別為3.14%、0.54%、0.47%。說明巴氏殺菌發(fā)酵乳YW11能夠提高腸道中產(chǎn)丁酸菌屬的豐度，對人體的健康有益。

圖6 巴氏殺菌發(fā)酵乳對厚壁菌門中菌群在屬水平結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Composition of Firmicutes at the genus level

Christopher等[26]研究結(jié)果顯示CD患者腸道微生物中棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）的含量減少。本實(shí)驗(yàn)中YW11組相比空白組，在分別與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，棲糞桿菌屬相對豐度分別增加了0.41%、2.65%。Morgan等[27]研究結(jié)果顯示CD患者腸道微生物中考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）的含量減少。本實(shí)驗(yàn)中YW11組相比空白組，在分別與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，考拉桿菌屬相對豐度分別增加了0.06%、1.76%。Rajili?-Stojanovi?等[28]研究發(fā)現(xiàn)UC患者腸道微生物中鏈球菌屬（Streptococcus）含量增加。本實(shí)驗(yàn)中YW11組相比空白組，在與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，鏈球菌屬相對豐度分別減少了0.06%、0.14%。人感染丹毒絲菌屬（Erysipelotrichaceae）會引發(fā)一種“類丹毒”病，本實(shí)驗(yàn)中YW11組相比空白組，在與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，丹毒絲菌屬相對豐度分別減少了1.96%、2.10%。但是，Gevers等[29]研究了447 例新發(fā)CD的兒童患者和221 例健康人群糞便菌群，發(fā)現(xiàn)CD的兒童患者糞便菌群丹毒絲菌豐度降低。大部分菌屬豐度的變化趨于緩解IBD癥狀的方向，因此可說明巴氏殺菌發(fā)酵乳對調(diào)節(jié)人體腸道菌群有益。

腸道菌群中乳桿菌（Lactobacillus）可保持腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性，阻止致病菌及毒素等物質(zhì)通過，保證腸壁屏障作用不受損害。有大量研究對厚壁菌門中乳酸菌的結(jié)果并不一致[30]。文獻(xiàn)[31]報道乳桿菌可以通過樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化，使Treg細(xì)胞分泌較高水平的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10來發(fā)揮其對IBD的治療效應(yīng)。IL-10可通過抑制IL-1、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎因子的釋放來保持腸道黏膜完整性，防止IBD的發(fā)生與惡化。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、維持腸道微生態(tài)的平衡、增強(qiáng)腸黏膜免疫功能在IBD的治療中就顯得尤為重要。腸道菌群中的Lactobacillus reuterii可將色氨酸轉(zhuǎn)變成3-吲哚甲酸，這種物質(zhì)能夠刺激芳香族化合物受體的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)[32]。本實(shí)驗(yàn)中YW11組與空白組相比，在與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，乳桿菌屬相對豐度分別增加了0.13%、0.31%。

2.2.3.2 擬桿菌門中菌群的組成

與厚壁菌門不同，研究者對擬桿菌門豐度在IBD患者中豐度的變化得出不一致的結(jié)果，文獻(xiàn)[33]提示擬桿菌門在IBD患者的腸道菌群中豐度有所增加，但其多樣性減少；也有研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸道菌中擬桿菌屬（Bacteroides）豐度減少[34]；多數(shù)研究表明，擬桿菌屬是保護(hù)性細(xì)菌，可以通過下調(diào)炎性因子、刺激抑炎因子以及調(diào)節(jié)黏膜屏障功能和通透性等一系列機(jī)制保護(hù)宿主，避免其發(fā)生炎癥反應(yīng)[35]。如圖7所示，相比空白組，在與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，YW11組擬桿菌屬豐度分別增加了7.78%、4.10%。

圖7 巴氏殺菌發(fā)酵乳對擬桿菌屬豐度的影響Fig. 7 Effect of the pasteurized fermented milk on abundance of Bacteroidetes

2.2.3.3 放線菌門中菌群的組成

腸道菌群中的雙歧桿菌（Bifidobacterium）可保持腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性，阻止致病菌及毒素等物質(zhì)通過，保證腸壁屏障作用不受損害[36]。雙歧桿菌有助于脂肪的消化吸收，一旦腸道內(nèi)雙歧桿菌比例降低，則容易誘發(fā)炎癥反應(yīng)，發(fā)生免疫缺陷性脂瀉病。Zhuang Xiaojun等[37]發(fā)現(xiàn)，中國腸易激綜合征患者腸道中雙歧桿菌豐度顯著減少[38]。在動物模型中，給予雙歧桿菌治療可減輕機(jī)體的炎癥水平，取得理想療效。如圖8所示，YW11組相比對照組，在與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，雙歧桿菌屬豐度分別增加了18.09%、7.48%。有研究發(fā)現(xiàn)柯林斯菌屬（Collinsella）在CD患者回腸中的含量減少[39]。YW11組相比對照組，在與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，柯林斯菌屬相對豐度分別增加了0.72%、0.80%。Wang Wei等[40]發(fā)現(xiàn)腸桿菌（Enterorhabdus）16S rRNA基因拷貝數(shù)的升高與硫酸葡聚糖誘導(dǎo)小鼠的IBD疾病活動性有關(guān)。Chassaing等[41]也得出一致的結(jié)論。YW11組相比對照組，在與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，腸桿菌屬的相對豐度分別減少了0.01%、0.01%。

圖8 巴氏殺菌發(fā)酵乳對放線菌門中菌群在屬水平結(jié)構(gòu)的影響Fig. 8 Composition of Actinobacteria at the genus level

2.2.3.4 變形菌門中菌群的組成

關(guān)于變形菌門中菌群與IBD關(guān)系報道的較少。Eun等[42]研究發(fā)現(xiàn)CD患者的腸道微生物中假單胞菌屬（Pseudomonas）的含量增加。在UC復(fù)發(fā)之前，正常厭氧菌埃希菌屬數(shù)量下降，同時，腸道微生物的多樣性減少[43]。如圖9所示，YW11組相比對照組，在分別與糞便共培養(yǎng)4 h和12 h后，假單胞菌屬的相對豐度減少，減少量分別為1.05%、1.05%；志賀埃希氏菌（Escherichia-Shigella）的豐度分別減少了0.14%、0.10%。

圖9 巴氏殺菌發(fā)酵乳對變形菌門中菌群在屬水平結(jié)構(gòu)的影響Fig. 9 Composition of Proteobacteria at the genus level

2.2.4 物種β多樣性分析

為了研究消化后的巴氏殺菌發(fā)酵乳在腸道中的停留時間及巴氏殺菌乳樣品對腸道菌群組成的影響，對腸道菌群進(jìn)行冗余分析。圖10所示，第1、2主成分對菌群的影響所能解釋的比例分別為43.7%、20.7%。培養(yǎng)時間、巴氏殺菌發(fā)酵乳環(huán)境因子和第1主成分的相關(guān)系數(shù)分別為0.659 7、0.801 9，其方向代表該因素對菌群影響的取向，長短代表對菌群影響的大小。培養(yǎng)4 h的樣品和培養(yǎng)12 h的樣品在培養(yǎng)時間影響因素的投影上長度一致，說明模型合理。菌群與培養(yǎng)時間、巴氏殺菌發(fā)酵乳環(huán)境因子射線的夾角及投影分別反應(yīng)了培養(yǎng)時間因素、巴氏殺菌發(fā)酵乳環(huán)境因子對該菌群影響的相關(guān)性和大小。經(jīng)過分析得出，71.43%的菌群與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)關(guān)系，即隨著培養(yǎng)時間的延長，菌群的豐度增大；28.57%的菌群與培養(yǎng)時間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。45.71%的菌群與巴氏殺菌發(fā)酵乳環(huán)境因子呈正相關(guān)關(guān)系，即巴氏殺菌發(fā)酵乳能增加其豐度；54.29%的菌群與巴氏殺菌發(fā)酵乳環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖10 腸道菌群的冗余分析Fig. 10 Redundancy analysis of the intestinal flora

3 結(jié) 論

植物乳桿菌YW11發(fā)酵液對沙門氏菌、阪崎腸桿菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌有不同程度的抑制作用。將益生性植物乳桿菌YW11應(yīng)用于巴氏殺菌發(fā)酵乳中能增加腸道微生態(tài)中菌群的豐富度和多樣性。在門水平，巴氏殺菌乳能增加厚壁菌門的豐度，減少變形菌門的豐度。在屬水平，整體看來，巴氏殺菌發(fā)酵乳能增加腸道中45.71%菌群的豐度，主要調(diào)節(jié)高豐度菌群；具體來看，巴氏殺菌發(fā)酵乳提高了產(chǎn)丁酸的毛螺旋菌屬、羅斯氏菌、瘤胃球菌屬及乳酸菌屬和雙歧桿菌的豐度，對人體的健康有益。同時，巴氏殺菌發(fā)酵乳增加了與緩解IBD炎癥相關(guān)的擬桿菌屬、糞棲桿菌、考拉菌屬、柯林斯菌屬的豐度，減少了與誘發(fā)IBD炎癥相關(guān)的丹毒絲菌屬、假單胞菌屬、志賀埃希氏菌的豐度。因此，巴氏殺菌發(fā)酵乳對腸道菌群結(jié)構(gòu)有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為益生性乳酸菌發(fā)酵乳的研發(fā)提供依據(jù)。