具有腸道動(dòng)力及腸道菌群調(diào)節(jié)功能乳桿菌的篩選及功能評(píng)價(jià)

沈旭丹，吉夢(mèng)馨，翟齊嘯，趙建新，張 灝，田豐偉*，陳 衛(wèi)

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

功能性便秘是一種臨床上常見的胃腸道疾病[1]。美國(guó)2011年流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，便秘在全世界的平均發(fā)病率為16%，其中中國(guó)約有20%～30%的人口受到便秘困擾[2]。功能性便秘的發(fā)病率逐年上升，且易受飲食、環(huán)境、情緒等多種因素影響，其中老年人發(fā)病率高于青壯年[3]，女性患者多于男性[4]，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為排便困難、次數(shù)少（頻率低于3 次/周），糞便干硬，常伴有腹痛、腹脹等癥狀，一般慢性便秘的病程長(zhǎng)達(dá)6 個(gè)月[5]。便秘的發(fā)生一般伴隨著腸道動(dòng)力及菌群失調(diào)，相關(guān)發(fā)病機(jī)制主要包括：膳食纖維、水分?jǐn)z入較少或?yàn)E用刺激性瀉藥，腸道敏感性降低；腫瘤等疾病壓迫腸道，腸蠕動(dòng)受機(jī)械性阻礙；腸平滑肌張力降低，排便肌群活動(dòng)障礙，蠕動(dòng)減弱[6]；腸道菌群紊亂[7]。有研究表明，便秘患者普遍存在焦慮、抑郁情緒，間接影響其在社會(huì)關(guān)系等領(lǐng)域的生活質(zhì)量[8]。此外，長(zhǎng)期便秘將會(huì)導(dǎo)致腸壁損傷，腸道中毒素聚集堆積，從而引起一系列全身性并發(fā)癥[9]。功能性便秘的個(gè)體差異較大，目前醫(yī)學(xué)上主要以針對(duì)緩解排便困難等癥狀，促進(jìn)恢復(fù)正常的腸道動(dòng)力為治療目標(biāo)，而市場(chǎng)上應(yīng)用于治療便秘以西藥瀉劑居多，諸如容積性瀉劑、滲透性瀉劑等，但瀉劑對(duì)于便秘患者適用性較為局限，且容易產(chǎn)生藥物依賴性，長(zhǎng)期服用會(huì)出現(xiàn)諸如腹脹、維生素吸收障礙等各種類型的副作用[10]。

益生菌是指給予（攝入）充足的數(shù)量能對(duì)宿主產(chǎn)生一種或多種特殊且經(jīng)臨床論證的功能性健康益處的活的微生物[11]，主要包括乳桿菌、雙歧桿菌等。研究表明，某些益生菌的攝入，能產(chǎn)生細(xì)菌素有效抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，從而改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)以及緩減堆積的酚類物質(zhì)的危害[12]；此外，益生菌能產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），降低結(jié)腸的pH值和傳輸時(shí)間，從而促進(jìn)腸道蠕動(dòng)[13]?？紤]到功能性便秘患者常伴有腸道菌群失調(diào)以及轉(zhuǎn)運(yùn)速率變慢，通過益生菌緩解便秘的研究逐漸引起重視，同時(shí)市場(chǎng)上也已出現(xiàn)了針對(duì)緩減便秘的微生物制劑。

目前常見的微生態(tài)制劑如培菲康、麗珠腸樂、整腸生、金雙歧等，主要以混菌制劑較多，且以雙歧桿菌和芽孢桿菌多見。有研究顯示，植物乳桿菌、干酪乳桿菌等多種乳桿菌也具有調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力以及腸道菌群的功能，具有成為治療便秘的微生態(tài)制劑的潛力。一項(xiàng)關(guān)于便秘人群的臨床研究表明，服用植物乳桿菌SN13T制劑6 周后，便秘人群的排便次數(shù)顯著增加，糞便指數(shù)趨近于4（4為最易排便的分?jǐn)?shù)）[14]。此外，曹永強(qiáng)[15]利用鹽酸洛哌丁胺建立便秘小鼠模型，發(fā)現(xiàn)攝入干酪乳桿菌N1115能促進(jìn)和改善便秘小鼠的腸道推進(jìn)率以及糞便質(zhì)量，同時(shí)有效地緩解便秘導(dǎo)致的腸道損傷。

綜合乳桿菌潛在的益生功能，本研究通過體外相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合考察了45 株來自泡菜或人類腸道的乳桿菌的生理特性，并對(duì)部分乳桿菌進(jìn)行了抗生素耐藥性評(píng)價(jià)，綜合篩選出了3 株安全并具有優(yōu)良特性的乳桿菌進(jìn)行調(diào)節(jié)腸道功能的體內(nèi)評(píng)價(jià)，以期獲得具有調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力以及腸道菌群功能的乳桿菌，豐富益生菌資源庫，并為其后續(xù)在腸道功能紊亂及相關(guān)疾病上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

乳桿菌均來源于江南大學(xué)生物技術(shù)中心菌種保藏庫，分別分離自發(fā)酵食品與健康人群新鮮糞便。菌株編號(hào)如下：LG1～LG4為格氏乳桿菌；LC5～LC13為干酪乳桿菌；LP14～LP22為植物乳桿菌；LB23～LB26為短乳桿菌；LB27～LB28為瑞士乳桿菌；LF29～LF39為發(fā)酵乳桿菌；LR40～LR45為鼠李糖乳桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；ISO-sensitest（IST）培養(yǎng)基 英國(guó)OXOID公司；LSM培養(yǎng)基：采用900 mL IST培養(yǎng)基、100 mL MRS培養(yǎng)基配制。

1.1.3 主要試劑

活性炭粉末、胰蛋白酶（1∶250） 上海生工試劑有限公司；膽鹽 上海拜力生物科技有限公司；胃蛋白酶（1∶15 000） 美國(guó)Sigma公司；易蒙停鹽酸洛哌丁胺膠囊（2 mg） 西安楊森制藥有限公司；糞便樣品基因組提取試劑盒（Fast DNA SPIN Kit for Feces） 美國(guó)MP公司；超薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）天根生化科技（北京）有限公司；低聚果糖（fructo oligosaccharides，F(xiàn)OS）、低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS） 保齡寶生物股份有限公司；低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）（純度95%）上海源葉生物科技有限公司。

低聚果糖的主要組成為40%～54%蔗果五糖、40%～42%蔗果四糖、6%～8%蔗果三糖以及5%葡萄糖；低聚半乳糖的主要組成為16%～21%低聚半乳二糖、38%～51%低聚半乳三糖、25%～29%低聚半乳四糖到八糖以及7%～10%乳糖。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康雄性BALB/c小鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0003），體質(zhì)量為20～22 g。購于江蘇蘇普斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫水槽、HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司；VarioskanLUX多功能微孔板讀數(shù)儀、酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；GCMS-QP2100氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、水平瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、Universal hood II凝膠成像儀 美國(guó)伯樂公司；Milli-Q水凈化系統(tǒng) 密理博（中國(guó)）有限公司；DZQ500真空包裝機(jī) 上海翔一包裝機(jī)械有限公司；NanoPhotometer超微量紫外分光光度計(jì) 德國(guó)IMPLEN公司；FastPrep-24核酸快速提取儀 美國(guó)MP公司；MiSeq第二代高通量測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；ZHJHC1115B型超凈工作臺(tái) 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌的體外特性篩選

1.3.1.1 乳桿菌的培養(yǎng)

將利用體積分?jǐn)?shù)30%的甘油保存的乳桿菌劃線活化后，分別按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，連續(xù)活化2 代后待用。

1.3.1.2 乳桿菌在模擬胃腸道中的耐受能力

模擬胃腸液的制備參考文獻(xiàn)[16]。活化好的菌株調(diào)節(jié)菌液初始濃度至109CFU/mL，重懸于等體積模擬胃液中培養(yǎng)3 h，離心重懸于等體積模擬腸液中培養(yǎng)4 h，分別進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，按照式（1）計(jì)算乳桿菌在耐酸耐膽鹽后的存活率。

式中：C為耐酸耐膽鹽后的菌液濃度/（CFU/mL）；C0為菌液初始濃度/（CFU/mL）。

1.3.1.3 乳桿菌利用低聚糖能力的測(cè)定

受試低聚糖為FOS、XOS和GOS。溴甲酚紫作為顯色劑，將活化后的菌液用生理鹽水重懸后點(diǎn)在含不同碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 h，觀察培養(yǎng)基變色情況[17-18]。

1.3.1.4 乳桿菌產(chǎn)SCFAs能力的測(cè)定

將活化好的菌株調(diào)節(jié)菌液初始濃度至2×108CFU/mL，菌液、10%硫酸以體積比25∶1混合酸化，加入4 倍10%硫酸體積的乙醚，振蕩混勻后，提取脂肪酸。18 000×g條件下離心15 min，分離上層乙醚相，并通過無水Na2SO4進(jìn)行干燥；靜置30 min后，18 000×g條件下繼續(xù)離心5 min，用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析上層乙醚相中的SCFAs。GC-MS檢測(cè)條件參考文獻(xiàn)[17]中方法。

1.3.1.5 乳桿菌的抗生素耐受性評(píng)價(jià)

乳酸菌的抗生素安全性評(píng)價(jià)方法見參考文獻(xiàn)[19]。其中，鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）對(duì)照菌株為ATCC 334；植物乳桿菌、短乳桿菌的MIC對(duì)照菌株為ATCC 14917。

1.3.2 乳桿菌對(duì)小鼠腸道功能的調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 灌胃菌株的制備

活化好的菌株洗滌3 次后重懸于12 g/100 mL的脫脂乳粉溶液中，－80 ℃保存。

1.3.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)[20]，將120 只BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分成10 組，每組12 只，分別為空白對(duì)照組（灌胃無菌生理鹽水）、3 株菌不同劑量的干預(yù)組（高、中、低劑量分別為1×1010、1×109、1×108CFU/kg mb，分別用H、M、L表示），灌胃15 d。實(shí)驗(yàn)期間，飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格控制在溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（50±5）%、光照12 h和黑夜12 h的環(huán)境中，小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所用的方法均經(jīng)過江南大學(xué)倫理委員會(huì)審閱并批準(zhǔn)（JN.No20170930b1101105），并符合歐盟實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南（Directive 2010/63/EU）。

1.3.2.3 小鼠健康指標(biāo)的測(cè)定

記錄實(shí)驗(yàn)第0天和第15天小鼠的體質(zhì)量、食物攝入量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按式（2）計(jì)算小鼠食物利用率。

1.3.2.4 小鼠小腸推進(jìn)率以及首粒排黑便時(shí)間的測(cè)定

灌胃第15天晚小鼠禁食過夜，次日隨機(jī)給每組中6 只小鼠灌胃鹽酸洛哌丁胺（模型組），30 min后灌胃活性炭溶液，記錄小鼠的首粒排黑便時(shí)間。30 min后處死，測(cè)量小腸總長(zhǎng)度，計(jì)量墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度，按式（3）計(jì)算小腸推進(jìn)率。

1.3.2.5 小鼠糞便水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及SCFAs含量的測(cè)定

灌胃第15天上午收集每只小鼠的糞便，稱量并記錄每只小鼠糞便濕質(zhì)量，干燥后記錄干質(zhì)量，按式（4）計(jì)算糞便的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。糞便中SCFAs含量的測(cè)定參考

1.3.1.4 節(jié)中的方法。

1.3.2.6 小鼠糞便菌群組成的測(cè)定

根據(jù)糞便試劑盒說明書提取小鼠糞便樣品中細(xì)菌基因組，并以此為模板，擴(kuò)增16S rDNA的V4區(qū)，PCR驗(yàn)證后進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物按照Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒說明書進(jìn)行定量。根據(jù)PicoGreen熒光染料的定量結(jié)果，按等質(zhì)量濃度混合樣品，樣品之間barcode不重復(fù)；按照Illumina建庫試劑盒TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit說明書構(gòu)建文庫，主要包括末端修復(fù)、3'端加A、接頭連接以及PCR擴(kuò)增等步驟。文庫構(gòu)建完成后，采用Bioanalyzer 2100儀測(cè)定DNA片段大小；按照KAPA Biosystems Library Quantification Kit試劑盒說明書，采用定量PCR法精確測(cè)定文庫的DNA質(zhì)量濃度。上機(jī)測(cè)序前的準(zhǔn)備工作、上機(jī)測(cè)序以及測(cè)序完成后下機(jī)數(shù)據(jù)處理參照文獻(xiàn)[21]中的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)表示為每組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)均設(shè)有至少3 組平行，統(tǒng)計(jì)分析圖通過GraphPad Prism 5和Origin 8.5軟件完成。采用SPSS軟件中的單因素方差分析和Duncan's多量程檢驗(yàn)對(duì)各組平均值的差異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌的體外特性分析

2.1.1 乳桿菌在模擬胃腸道中的耐受能力

研究表明，益生菌對(duì)腸道功能的調(diào)節(jié)能力與其在腸道中的活菌數(shù)密切相關(guān)。Li Xiangfei等[22]分別用干酪乳桿菌死菌和活菌處理糖尿病小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于死菌，活菌更加顯著地提高了小鼠腸道內(nèi)SCFAs的濃度以及Akkermansia等有益菌的相對(duì)豐度，同時(shí)促進(jìn)了糖尿病小鼠腸道內(nèi)普遍偏少的L細(xì)胞的增殖，通過腸道相關(guān)功能的改善進(jìn)一步緩減了糖尿病癥狀。因此，益生菌能否通過胃酸環(huán)境，繼續(xù)耐受腸道的高膽鹽，并以活菌形式到達(dá)小腸是其在腸道中發(fā)揮作用的前提。

本實(shí)驗(yàn)參考了常用的模擬胃腸道方法，探究初始濃度均為2×108CFU/mL的不同乳桿菌在先耐受pH值為3.0的胃液3 h，繼續(xù)耐受含3 g/L膽鹽的腸液4 h后的存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同乳桿菌的耐酸、耐膽鹽能力存在顯著差異，其中瑞士乳桿菌LB25最高，達(dá)到了34.18%，而最低的格氏乳桿菌LG1的存活率僅有0.15%。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠李糖乳桿菌LGG作為耐酸、耐膽鹽實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)參考，其耐酸、耐膽鹽后的平均存活率為6.35%，與Mandal等[23]測(cè)得LGG耐受0.3%膽鹽2 h后的平均存活率81%相差較大，而與Li Chun等[24]探究的凍干粉LGG在耐受等質(zhì)量濃度的腸液4 h后的存活率為4.74%較為相近。通過實(shí)驗(yàn)方法的比較，推測(cè)可能是由于Mandal等的實(shí)驗(yàn)過程中采用MRS培養(yǎng)基作為膽鹽的載體，耐受環(huán)境營(yíng)養(yǎng)豐富，適宜乳桿菌的生長(zhǎng)，從而緩減了膽鹽對(duì)LGG的損傷程度。而Li Chun等實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)較為相似，也進(jìn)一步表明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。本實(shí)驗(yàn)各菌株的耐酸耐膽鹽結(jié)果如圖1所示，在連續(xù)經(jīng)受胃液和腸液后，受試乳桿菌的存活率均顯著降低，僅有11 株乳桿菌的最終存活率在10%以上，其中LC9、LP17、LB25、LF38的存活率在20%以上，表現(xiàn)出了良好的耐酸、耐膽鹽能力。

圖1 乳桿菌耐酸耐膽鹽后的存活率Fig. 1 Tolerance of Lactobacillus to simulated gastric juice and intestinal juice

2.1.2 乳桿菌利用低聚糖特性的研究

FOS、GOS、XOS均為功能性低聚糖，此類低聚糖不能被機(jī)體吸收，乳桿菌如果能利用低聚糖，在腸道中快速生長(zhǎng)繁殖，就能占領(lǐng)優(yōu)勢(shì)生態(tài)位，改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs，調(diào)節(jié)結(jié)腸pH值，抑制致病菌的增殖[25]，此外還能促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、脂肪代謝以及調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫，有利于宿主的健康[26]。

表1 乳桿菌對(duì)低聚糖的偏好性Table 1 Preferential utilization of oligosaccharides by Lactobacillus

由表1可知，干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌普遍都能利用這3 種低聚糖，但個(gè)體之間存在一定的差異。乳桿菌代謝低聚糖時(shí)需要借助于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及胞內(nèi)糖苷酶的參與。Goh等[27]總結(jié)了4 種乳桿菌代謝FOS、GOS的不同途徑，指出不同種/株乳桿菌在代謝低聚糖時(shí)可能受轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量、ATP數(shù)量等因素的制約，從而解釋了本實(shí)驗(yàn)中菌株之間對(duì)低聚糖利用能力的差異性。此外，G?nzle等[28]綜合了17 種乳桿菌中編碼4 類低聚糖代謝的基因分布，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌以及植物乳桿菌中相關(guān)代謝基因比較豐富，可能具有良好的低聚糖利用能力，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。2.1.3 乳桿菌產(chǎn)SCFAs能力的研究

乳桿菌在體內(nèi)發(fā)酵低聚糖產(chǎn)生SCFAs，主要為乙酸、丙酸、丁酸等。這些SCFAs參與機(jī)體相關(guān)代謝，能促進(jìn)機(jī)體對(duì)某些電解質(zhì)的吸收以及腸上皮細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)腸道免疫，恢復(fù)胃腸道的完整性和功能性，間接干預(yù)其他生理效應(yīng)[29]。因此，乳桿菌產(chǎn)SCFAs的能力也是評(píng)價(jià)其對(duì)腸道功能調(diào)節(jié)作用的一個(gè)重要指標(biāo)。

圖2 不同乳桿菌產(chǎn)SCFAs能力的比較Fig. 2 Comparison of contents of short chain fatty acids produced by various Lactobacillus strains

圖4 不同乳桿菌產(chǎn)丙酸能力的比較Fig. 4 Comparison of contents of propionic acid produced by various Lactobacillus strains

圖5 不同乳桿菌產(chǎn)丁酸能力的比較Fig. 5 Comparison of contents of butyric acid produced by various Lactobacillus strains

由圖2～5可知，乙酸的產(chǎn)量占SCFAs總產(chǎn)量的絕大部分，其中所有的受試乳桿菌均可以產(chǎn)4 種SCFAs，但產(chǎn)酸能力具有差異性，格氏乳桿菌LG1（（3.20±0.50）mmol/L）、植物乳桿菌LP21（（3.60±0.38）mmol/L）、發(fā)酵乳桿菌LF37（（3.64±0.24）mmol/L）和鼠李糖乳桿菌LR45（（2.90±0.05）mmol/L）具有良好的產(chǎn)SCFAs能力。

2.1.4 乳桿菌的安全性評(píng)價(jià)

微生物對(duì)抗生素的耐受能力往往源于其固有耐藥性或獲得性耐藥性。其中，故有耐藥性為天然耐藥性，抗性基因位于染色體上，相對(duì)穩(wěn)定；而獲得性耐藥性主要是由基因的水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，此類基因多位于質(zhì)粒上，而質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的宿主范圍十分廣泛[30]。?t?epetova等[31]通過檢測(cè)腸道菌對(duì)多種不同抗生素的耐藥能力及其耐藥基因，進(jìn)一步驗(yàn)證了微生物的耐藥性可能來自于質(zhì)粒。一般認(rèn)為，腸道細(xì)菌若具有抗生素耐藥基因，且耐藥基因不穩(wěn)定，則可能通過水平轉(zhuǎn)移至致病菌，從而危害人體健康。有研究表明，極少數(shù)乳桿菌菌株的耐藥性基因是由質(zhì)粒編碼的[32]，因此，評(píng)價(jià)乳桿菌的抗生素耐受性對(duì)其安全使用具有重要意義。

表2 不同乳桿菌的抗生素MIC（A）Table 2 Minimal inhibitory concentrations of antibiotics against various Lactobacillus strains (A)

表3 不同乳桿菌的抗生素MIC（B）Table 3 Minimal inhibitory concentrations of antibiotics against various Lactobacillus strains (B)

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)乳桿菌耐酸耐膽鹽、低聚糖利用及產(chǎn)SCFAs能力的結(jié)果，綜合選擇15 株生理性質(zhì)較好的乳桿菌進(jìn)行抗生素安全性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法參考ISO 10932—2010。由表2、3可知，除發(fā)酵乳桿菌LF34外，其余14 株乳桿菌的抗生素安全性均符合要求，氯霉素MIC為1.30×10－7～20.00×10－7g/mL，紅霉素MIC為1.00×10－9～250.00×10－9g/mL，克林達(dá)霉素MIC為2.00×10－8～25.00×10－8g/mL，新霉素、鏈霉素和慶大霉素的MIC分別為2.50×10－7～80.00×10－7、5.00×10－7～80.00×10－7、2.50×10－7～20.00×10－7g/mL。與前人研究一致，受試乳桿菌對(duì)能夠抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素如氯霉素、紅霉素等較敏感[33]。

2.2 乳桿菌對(duì)小鼠腸道功能的調(diào)節(jié)作用

2.2.1 所選菌株對(duì)小鼠健康指標(biāo)的影響

圖6 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的體質(zhì)量增加量Fig. 6 Body mass gains of mice

圖7 實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠的食物利用率Fig. 7 Food utilization rates of mice

綜合考慮耐酸、耐膽鹽、低聚糖利用能力、產(chǎn)SCFAs能力以及抗生素耐受性，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌LC9、發(fā)酵乳桿菌LF37和鼠李糖乳桿菌LR45能在腸道中保持更好活性，因此，挑選這3 株菌進(jìn)行研究。由圖6、7可知，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)過程中略有上升，而除干酪乳桿菌LC9-L干預(yù)組的食物利用率低于空白組外，其余干預(yù)組的食物利用率均高于空白組，且組間并沒有顯著性差異，說明所選3 株乳桿菌灌胃15 d后對(duì)小鼠的健康無負(fù)作用。

2.2.2 所選菌株對(duì)小鼠腸道運(yùn)動(dòng)的影響

小腸推進(jìn)率與首粒排黑便時(shí)間分別反映了小腸和整個(gè)腸道的運(yùn)動(dòng)能力。在腸道蠕動(dòng)抑制模型造模過程中，與空白組相比，模型組小腸推進(jìn)率顯著降低，首粒排黑便時(shí)間顯著延長(zhǎng)，說明造模成功[21]。

由圖8、9可知，干酪乳桿菌LC9和發(fā)酵乳桿菌LF37這2 株菌的3 個(gè)劑量組小腸推進(jìn)率均顯著高于模型組，以及首粒排黑便時(shí)間均顯著低于模型組，說明這2 株菌可以促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，加速排便。而鼠李糖乳桿菌LR45改善腸道運(yùn)動(dòng)能力上具有濃度依賴效應(yīng)。

圖8 灌胃結(jié)束后小鼠的小腸推進(jìn)率Fig. 8 Small intestinal transition rates of mice after gavage

圖9 灌胃結(jié)束后小鼠的首粒排黑便時(shí)間Fig. 9 First black stool defecation time of mice after gavage

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[20]中的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)與黑便實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性即可判定干酪乳桿菌LC9、發(fā)酵乳桿菌LF37和鼠李糖乳桿菌LR45具有提高腸道動(dòng)力/促進(jìn)排便的保健功能。

2.2.3 所選菌株對(duì)小鼠糞便水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及SCFAs含量的影響

糞便水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和SCFAs含量是評(píng)價(jià)糞便質(zhì)量的2 個(gè)重要指標(biāo)。大便干燥容易引起便秘，而SCFAs主要是由結(jié)腸內(nèi)厭氧菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生，可以降低腸道pH值，增殖有益菌、抑制有害菌以調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道功能[34]。王琳琳[21]將4 種SCFAs分別處理實(shí)驗(yàn)小鼠，發(fā)現(xiàn)處理后小鼠血清中5-羥色胺分泌增加，腸道肌肉收縮、蠕動(dòng)能力增強(qiáng)，結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)速率加快。

圖10 灌胃第15天時(shí)小鼠的糞便水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 10 Defecation status of mice on Day 15 of intragastric administration

由圖10可知，各組小鼠的糞便形態(tài)和糞便水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在正常范圍內(nèi)，干預(yù)組干酪乳桿菌LC9-H、LC9-M組小鼠的糞便水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于空白組。

表4 灌胃第15天時(shí)小鼠糞便中SCFAs的含量Tab. 4 Contents of SCFAs in feces on Day 15 of intragastric administration

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃菌液前，各組小鼠腸道內(nèi)各種SCFAs含量并無顯著差異。由表4可知，灌胃后各乳桿菌處理組小鼠的SCFAs含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中，干酪乳桿菌LC9-M組乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸的含量均顯著增加，發(fā)酵乳桿菌LF37-M干預(yù)組乙酸與正丁酸的含量顯著上升，鼠李糖乳桿菌LR45-M組丙酸的含量顯著上升。體外實(shí)驗(yàn)表明受試乳桿菌具有一定的產(chǎn)SCFAs能力，從而解釋了其攝入后小鼠糞便內(nèi)SCFAs含量的提高。但SCFAs增加量顯著高于其體外產(chǎn)酸能力，可能是受試乳桿菌在小鼠腸道內(nèi)產(chǎn)生一定量的SCFAs，降低了腸道pH值，從而促進(jìn)了產(chǎn)SCFAs菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)一步提高了腸道中SCFAs的含量。

2.2.4 所選菌株對(duì)小鼠糞便菌群的影響

圖11 小鼠糞便菌群門水平相對(duì)豐度Fig. 11 Relative abundance of mouse fecal microbiota at phylum level

由圖11可知，小鼠糞便菌群中共檢測(cè)出7 個(gè)門，主要由Firmicutes（（26.7±4.5）%）和Bacteroidetes（（61.6±0.3）%）組成，除干酪乳桿菌LC9-H外的所有干預(yù)組小鼠糞便中Verrucomicrobia的相對(duì)豐度與空白組相比均明顯增加，其中干酪乳桿菌LC9-H、發(fā)酵乳桿菌LF37-H、鼠李糖乳桿菌LR45-L干預(yù)組小鼠糞便中Firmicutes的相對(duì)豐度明顯降低，干酪乳桿菌LC9-M、LC9-L干預(yù)組小鼠糞便中Proteobacteria的相對(duì)豐度明顯增加。

圖12 小鼠糞便中相對(duì)豐度大于0.1%的菌屬Fig. 12 Relative abundance of genera above 0.1% in mouse fecal microbiota

由圖12可知，小鼠糞便菌群中共檢測(cè)出254 個(gè)屬，其中相對(duì)豐度超過0.1%的屬有30 個(gè)。小鼠腸道菌群中相對(duì)豐度最高的2 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬分別屬于S24-7與Rikenellaceae。與空白組相比，所有干預(yù)組小鼠糞便中Lactobacillus、Akkermansia的相對(duì)豐度均明顯增加，除發(fā)酵乳桿菌LF37-M、鼠李糖乳桿菌LR45-H、LR45-L外，其余干預(yù)組Allobaculum的相對(duì)豐度明顯增加，而Clostridiales的相對(duì)豐度明顯下降。此外，所有干預(yù)組Lachnospiracea未知菌屬的相對(duì)豐度明顯降低。

Akkermansia屬于Verrucomicrobia門，研究表明，Akkermansia能通過降解黏蛋白產(chǎn)生SCFAs，對(duì)宿主代謝異常如肥胖以及免疫疾病如腸道炎癥等有一定調(diào)節(jié)作用[35]，而Allobaculum、Clostridiales屬于Firmicute門，其中Allobaculum與飲食中脂肪含量的高低密切相關(guān)，能促進(jìn)腸道丙酸的產(chǎn)生，改善腸道微環(huán)境[36]，Akkermansia、Allobaculum相對(duì)豐度的提高進(jìn)一步解釋了小鼠腸道內(nèi)SCFAs含量的增加。此外，有研究顯示，Clostridiales相對(duì)豐度的增加可能與一些腸道并發(fā)癥如結(jié)腸炎等的發(fā)生有關(guān)[37]。綜合門、屬水平的菌群差異可知，所選乳桿菌對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié) 論

諸多研究表明，腸道功能紊亂與功能性便秘等腸道疾病密切相關(guān)，而外源性益生菌的補(bǔ)充能有效地調(diào)節(jié)腸道功能[38]。本實(shí)驗(yàn)通過乳桿菌生理特性體外實(shí)驗(yàn)的篩選與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的功能評(píng)價(jià)，最終從45 株乳桿菌中篩選出3 株具有調(diào)節(jié)腸道功能的乳桿菌，分別為干酪乳桿菌LC9、發(fā)酵乳桿菌LF37和鼠李糖乳桿菌LR45，這3 種乳桿菌在耐受模擬胃腸道消化后仍能保持一定的活性，能發(fā)酵3 種低聚糖，兼?zhèn)淞己玫漠a(chǎn)SCFAs能力。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這3 株菌均可以提高小鼠的小腸推進(jìn)率，縮短首粒排黑便時(shí)間，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，并進(jìn)一步增加了有益菌在腸道菌群中的相對(duì)豐度，改善糞便菌群結(jié)構(gòu)。因此，這3 株菌可以作為潛在的益生菌，應(yīng)用于腸道功能的調(diào)節(jié)。