氣相色譜-質(zhì)譜法/同位素內(nèi)標(biāo)法測定白酒中16種鄰苯二甲酸酯的優(yōu)化研究

蘇占元，張宿義*，趙金松，4，，張 良，黃小軍，楊曉軍，許 愿，吳衛(wèi)宇，楊 平，秦 輝

（1.四川國檢檢測有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000；4.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；5.瀘州老窖集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646000）

鄰苯二甲酸酯（phthalate acid esters，PAEs）是塑化劑中的一種，是工業(yè)上常用的高分子材料增塑劑[1-3]。鄰苯二甲酸酯常溫條件下一般為無色透明的油狀黏稠液體，屬于脂溶性物質(zhì)，易溶于正己烷、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑[4]。鄰苯二甲酸酯可以改變?nèi)梭w內(nèi)荷爾蒙雌激素水平，被當(dāng)作內(nèi)分泌干擾素或環(huán)境激素，并可對人體免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)造成傷害[5-9]。根據(jù)2011年原衛(wèi)生部的通知，鄰苯二甲酸酯是可用于食品包裝材料的增塑劑，但不是食品原料，也不是食品添加劑，嚴(yán)禁在食品、食品添加劑中人為添加，并且食品、食品添加劑中的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（dioctyl phthalate，DEHP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate，DINP）和鄰苯二甲酸二正丁酯（dibutylphthalate，DBP）的最大殘留量分別為1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg[10]，該要求僅用于排查違法添加行為，不是食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。2014年原國家衛(wèi)計委再次評估，確定對飲酒者健康風(fēng)險處于可接受水平的DBP限值為1.0mg/kg、DEHP限值為5.0mg/kg。同時，衛(wèi)計委明確，2014年評估結(jié)果僅從保護(hù)健康角度得出，未考慮其他相關(guān)因素，不是食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[11]。只要排除違法添加行為，白酒中DBP與DEHP滿足2014年評估要求，就能保證飲酒者健康風(fēng)險處于可接受水平。目前大多數(shù)白酒廠，將與酒源直接接觸的材質(zhì)已換成食品級不銹鋼（通常采用304），但少數(shù)小酒廠仍然使用含有塑化劑的塑料接酒桶、塑料輸酒管道等，由于鄰苯二甲酸酯具有易遷移及在酒精溶劑中具有較好的溶解性特點，長時間接觸過程中鄰苯二甲酸酯極易遷移到白酒中，容易造成市售散裝白酒存在鄰苯二甲酸酯含量較高的潛在風(fēng)險[4，12-14]。因此有必要開展白酒中鄰苯二甲酸酯的檢測工作，指導(dǎo)白酒行業(yè)使其含量處于可控、安全水平。

目前檢測白酒中鄰苯二甲酸酯的現(xiàn)行有效方法GB 5009.271—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鄰苯二甲酸酯的測定》[15]包括第一法氣相色譜-質(zhì)譜法同位素內(nèi)標(biāo)法及第二法氣相色譜-質(zhì)譜法外標(biāo)法，無論是氣相色譜-質(zhì)譜法同位素內(nèi)標(biāo)法還是氣相色譜-質(zhì)譜法外標(biāo)法，對于白酒的檢測，前處理方式均為液液萃取，簡單快速成本較低，但是氣相色譜-質(zhì)譜法外標(biāo)法對質(zhì)譜靈敏度及穩(wěn)定性要求較高；氣相色譜-質(zhì)譜法同位素內(nèi)標(biāo)法在質(zhì)譜靈敏度滿足檢測要求的情況下受質(zhì)譜穩(wěn)定性影響較小，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，但是按照標(biāo)準(zhǔn)要求在液液萃取之前需要手動加入一定量的內(nèi)標(biāo)使用液，內(nèi)標(biāo)使用液的使用量相對較大造成檢測成本的增加，并且手動加內(nèi)標(biāo)使用液對檢測人員的熟練度準(zhǔn)確度要求較高。因此，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的情況下，有必要對第一法中的氣相色譜-質(zhì)譜法同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行優(yōu)化。

本實驗參照現(xiàn)行有效國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.271—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鄰苯二甲酸酯的測定》，并利用與氣相色譜儀匹配的Agilent7693自動液體進(jìn)樣器自動添加內(nèi)標(biāo)，對白酒中的鄰苯二甲酸酯進(jìn)行檢測，以優(yōu)化該方法的氣相色譜-質(zhì)譜條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成品白酒：市售；水：符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水，本實驗室自制；正己烷（色譜純）：美國OMNI公司；25mL具塞磨口離心管：瀘州市宏鑫化工有限公司。

16種鄰苯二甲酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000mg/L）（鄰苯二甲酸二甲酯（dimethylphthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethylphthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、鄰苯二甲酸二正丁酯、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（bis（2-methoxyethyl）phthalate，DMEP）、鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（bis（4-methyl-2-pentyl）phthalate，BMPP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（bis（2-ethoxyethyl）phthalate，DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（dipentyl phthalate，DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（dihexyl phthalate，DHXP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（benzyl butylphthalate，BBP）、鄰苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（bis（2-n-butoxyethyl）phthalate，DBEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexylphthalate，DCHP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯、鄰苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPhP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（dinoctylphthalate，DNOP）、鄰苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP））：美國o2sismartsolutions公司。

16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100mg/L）（D4-鄰苯二甲酸二甲酯（D4-DMP）、D4-鄰苯二甲酸二乙酯（D4-DEP）、D4-鄰苯二甲酸二異丁酯（D4-DIBP）、D4-鄰苯二甲酸二正丁酯（D4-DBP）、D4-鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（D4-DMEP）、D4-鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（D4-BMPP）、D4-鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（D4-DEEP）、D4-鄰苯二甲酸二戊酯（D4-DPP）、D4-鄰苯二甲酸二己酯（D4-DHXP）、D4-鄰苯二甲酸丁基芐基酯（D4-BBP）、D4-鄰苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（D4-DBEP）、D4-鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（D4-DCHP）、D4-鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（D4-DEHP）、D4-鄰苯二甲酸二苯酯（D4-DPhP）、D4-鄰苯二甲酸二正辛酯（D4-DNOP）、D4-鄰苯二甲酸二壬酯（D4-DNP））：美國o2si smartsolutions公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent7890A GC/5975CMSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）、Agilent7693自動液體進(jìn)樣器：美國Agilent公司；BSA5201電子天平（220g，0.1mg）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；移液槍（0～100μL及100～1 000μL）：大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司；SK-1渦旋混勻器：金壇市醫(yī)療儀器廠；AS3120超聲波清洗儀：北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司；KH19A高速離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制16種鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（20mg/L）、16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10mg/L）、16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（0.125mg/L），用正己烷準(zhǔn)確定容至刻度，冰箱中0～8℃冷藏避光保存。

1.3.2 樣品前處理[15]

準(zhǔn)確稱取酒樣1.0 g于25m L具塞磨口離心管中，加入2～5m L蒸餾水，渦旋均勻，再準(zhǔn)確加入10m L正己烷，渦旋1min，劇烈振搖1min，超聲提取30min，1 000 r/min離心5m in，取上清液，供GC-MS分析，同時選擇與Agilent7890A氣相色譜儀配套使用的Agilent7693自動液體進(jìn)樣器并在其L2位置放置1mL質(zhì)量濃度為0.125mg/L的16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.3.3 GC-MS條件

色譜柱：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣（He，99.999%）；流速：1m L/m in；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣類型：2層夾層模式，L1氣隙0.2 μL，L2體積1 μL，L2氣隙0.2 μL；載氣節(jié)?。?0.0m L/m in；進(jìn)樣口溫度：280℃；程序升溫：初始溫度60℃保持1min，以20℃/min升溫至220℃保持1min，再以5℃/min升溫至280℃保持2min；傳輸線溫度：280℃；離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃，四級桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：5min；質(zhì)量掃描范圍：30～400m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜定性定量[16]

取1m L16種鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（20mg/L）采用1.3.2的方式，并按照1.3.3條件進(jìn)行全掃描，得到16種鄰苯二甲酸酯及其氘代同位素內(nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖，見圖1A；完全按照國標(biāo)中的氣相色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行全掃描，得到16種鄰苯二甲酸酯及其氘代同位素內(nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖，見圖1B。并利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standardsand technology，NIST）數(shù)據(jù)庫2012標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫進(jìn)行檢索，確定每種物質(zhì)的保留時間和特征離子碎片，選擇豐度相對較高的離子作為定性離子，把豐度較高并且與相鄰峰之間無干擾的離子作為定量離子，選擇結(jié)果見表1和表2。

圖1 優(yōu)化后（A）、優(yōu)化前（B）16種鄰苯二甲酸酯的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chrom atogram of 16 phthalate acid esters after(A)and before(B)optim ization

表1 16種D4-鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性和定量離子Table 1 Retention time,qualitative ion and quantitative ion of 16 D4-phthalate acid esters

表2 16種鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性和定量離子Table 2 Retention time,qualitative ion and quantitative ion of 16 phthalate acid esters

通過提高進(jìn)樣口溫度可以使沸點較高的物質(zhì)得到充分汽化增加其分離度，同時防止色譜柱污染尤其是柱前端的污染。在色譜圖中間流出峰的分離度可以通過改變升溫速率來改變，如果分離度過大，可以增加升溫速率以減小分離度和縮短分析時間；如果分離度不足，可以減少升溫速率來改善，并且減少升溫速率時，較晚流出峰的分離度增加更明顯[17]。由圖1可以看出，優(yōu)化氣相色譜質(zhì)譜條件前DEHP和DPhP未能有效分離開，通過提高進(jìn)樣口溫度及改變程序升溫條件后16種目標(biāo)物質(zhì)得到了較好的分離，并且峰形對稱，說明優(yōu)化后的色譜條件能夠滿足檢測需求。

2.2 方法線性范圍

表3 16種鄰苯二甲酸酯的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges,linear equations and correlation coefficients(R2)of 16 phthalate acid esters

將16種鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（20mg/L）用正己烷逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.02mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L、0.20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，采用1.3.2的方式，并按照1.3.3條件上機(jī)測定。以鄰苯二甲酸酯各組分及其對應(yīng)氘代同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分含量（mg/L）與對應(yīng)氘代同位素內(nèi)標(biāo)含量（mg/L）比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到各組分的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，在0.02～0.20mg/L范圍內(nèi)，16種鄰苯二甲酸酯的線性回歸方程均具有良好的線性關(guān)系R2≥0.998。

2.3 方法檢出限、精密度和加標(biāo)回收率

檢出限和定量限主要是考察方法的靈敏度；而回收率主要是考察方法的準(zhǔn)確度[16]。取本底中不含這16種鄰苯二甲酸酯的白酒樣品，分別按0.3mg/kg、0.5mg/kg及1.0mg/kg的水平添加，每個水平檢測6次，考察該方法的精密度、加標(biāo)回收率；并利用0.5mg/kg的濃度水平為依據(jù)，3倍信噪比計算檢出限，10倍信噪比計算定量限[18-20]，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，3個質(zhì)量濃度水平的16種鄰苯二甲酸酯平均回收率為88.6%～106.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.6%～4.3%；DBP的定量限為6.6×10-3mg/kg，其余15種均小于3.0×10-2mg/kg，完全滿足標(biāo)準(zhǔn)中DBP定量限為0.3mg/kg，其余15種均為0.5mg/kg的要求。說明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和靈敏度，能夠滿足白酒中16種鄰苯二甲酸酯的檢測。

表4 16種鄰苯二甲酸酯的方法檢出限、精密度和加標(biāo)回收率實驗結(jié)果（n=6）Table 4Detection lim its,precision and adding standard recovery of16 phthalate acid esters(n=6)

2.4 實際樣品分析

利用本實驗所建立的方法，對市售5份不同白酒樣品的16種鄰苯二甲酸酯含量進(jìn)行檢測，每個樣品平行測定6次，檢測結(jié)果見表5。由表5可知，5份白酒樣品有檢出的主要集中在DIBP、DBP及DEHP，其中DBP均有檢出，其余指標(biāo)均未檢出。

表5 5份白酒樣品中16種鄰苯二甲酸酯的測定結(jié)果（n=6）Table 5 Determ ination results of 16 phthalate acid esters in5 Baijiu samples(n=6)

3 結(jié)論

參照現(xiàn)行有效國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.271—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鄰苯二甲酸酯的測定》，對該方法中的氣相色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用與氣相色譜儀匹配的自動液體進(jìn)樣器自動添加內(nèi)標(biāo)，對白酒中的16種鄰苯二甲酸酯進(jìn)行檢測。優(yōu)化條件后，能使白酒中16種鄰苯二甲酸酯得到較好的分離，在0.02～0.20mg/L范圍內(nèi)，16種鄰苯二甲酸酯具有良好的線性關(guān)系，R2≥0.998。鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）的定量限為6.6×10-3mg/kg，其余15種的定量限均小于3.0×10-2mg/kg，平均回收率為88.6%～106.1%，RSD為1.6%～4.3%。本實驗所建立的方法能夠節(jié)省內(nèi)標(biāo)使用量，并且具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，能夠滿足上述國標(biāo)對白酒中鄰苯二甲酸酯檢測的要求，進(jìn)而對于指導(dǎo)白酒行業(yè)使鄰苯二甲酸酯含量處于可控、安全水平具有現(xiàn)實意義。