• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及生長(zhǎng)條件的研究

      2019-08-30 02:21:34陳正培吳婉瑩余啟明蔡錦源熊建文
      中國(guó)釀造 2019年8期
      關(guān)鍵詞:果漿百香果內(nèi)生

      陳正培,吳婉瑩,張 銀,向 煜,余啟明,蔡錦源,熊建文*

      (廣西科技大學(xué) 鹿山學(xué)院 食品與化學(xué)工程系,廣西 柳州 545616)

      百香果(Passionfora edulis)屬于西番蓮科,又稱雞蛋果、巴西果,其主產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū),于1913年引入我國(guó)。目前在臺(tái)灣、福建、廣西、云南等地均有種植,且得到了大力發(fā)展[1-2]。百香果主要分為紫色百香果和黃色百香果,其中紫色百香果在市面上更為常見[3]。百香果果汁豐富,香味濃郁,含有豐富的揮發(fā)性香味成分,PERESTRELOR等[4]研究表明,百香果香味成分達(dá)到103種,其中包含了蘋果、香蕉等水果中的主要香味成分,百香果也是因此而得名,并享有“果汁之王”的美譽(yù)[5-6]。百香果營(yíng)養(yǎng)成分豐富,不僅含有7種人體必需氨基酸、多種對(duì)人體有益的礦物質(zhì)元素(Na、K、Ca 、Mg、Zn、Fe、Ge),還含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素C、維生素E和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-8]。

      百香果果汁偏酸,不宜直接食用,因此其果漿常被加工成果汁飲品。為了豐富百香果果汁飲品的種類,滿足人們對(duì)生活質(zhì)量日益提高的要求,對(duì)百香果果汁研究從單一的果汁飲料逐漸向復(fù)合的果汁飲料轉(zhuǎn)變。如將百香果分別與芒果、菠蘿、雪梨、黃瓜、火龍果、沙田柚等水果研制成復(fù)合果汁飲品[9-17]。此外,石小瓊等[18]研發(fā)了糯米百香果果酒;楊玉霞等[19-21]對(duì)百香果果酒的發(fā)酵進(jìn)行了探索,均得到了較好的發(fā)酵工藝;潘嫣麗等[22]對(duì)百香果果醋進(jìn)行了研發(fā)。目前,對(duì)百香果果漿的研究主要集中在成分分析、果汁加工工藝、果汁的保藏等方面,然而對(duì)百香果果漿中的內(nèi)生菌研究鮮見報(bào)道。陸小平等[23]分別從香蕉、柑橘中分離到的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)常見的植物病原菌具有一定的拮抗作用,而百香果果汁存在的內(nèi)生細(xì)菌是否有類似的作用,百香果內(nèi)生細(xì)菌對(duì)深加工有何影響等問題尚不清楚。因此,對(duì)百香果果汁內(nèi)生菌的分離和鑒定具有一定的研究?jī)r(jià)值。

      本研究以柳州地區(qū)紫色百香果鮮果為原料,采用平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate countagar,PCA)培養(yǎng)基從百香果中分離純化得到內(nèi)生細(xì)菌,通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定,并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行研究。通過對(duì)百香果果漿內(nèi)生菌的研究,可以為后續(xù)解決百香果果漿加工過程中發(fā)生的內(nèi)源性微生物污染提供參考依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1 材料

      新鮮百香果:種植于柳州地區(qū)的紫色百香果。

      1.1.2 試劑

      蛋白胨、酵母提取物(均為生化試劑):廣東環(huán)凱微生物有限公司;瓊脂粉(生化試劑):北京索來寶生物有限公司;瓊脂糖(分析純):法國(guó)BIOWEST公司;2×MasterM ix:美國(guó)Thermo公司;Ⅱ型核酸染料:北京派拓科技有限公司;脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒:天根生化試劑(北京)有限公司。

      1.1.3 培養(yǎng)基

      平板計(jì)數(shù)瓊脂(液)培養(yǎng)基:胰蛋白胨5 g,酵母浸粉2.5 g,葡萄糖1.0 g,蒸餾水1 L。

      LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L。LB液體培養(yǎng)基中不加入瓊脂。

      牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl5 g,蒸餾水1 L。

      以上培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌20min。

      1.2 儀器與設(shè)備

      UV-1800型紫外可見分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司;L9800聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(polymerase chain reaction,PCR儀):萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司;Nikon Eclipse E200光學(xué)顯微鏡:上海衡浩儀器有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 樣品處理

      選取成熟度一致、表面無任何機(jī)械損傷、大小均勻的新鮮的百香果作為實(shí)驗(yàn)材料,在超凈工作臺(tái)中,先用無菌水沖洗百香果表面,再將百香果放置在裝有體積分?jǐn)?shù)75%乙醇的燒杯中,浸泡5~10min,取出,無菌水果刀切掉端部,用無菌槍頭輕戳百香果果肉,使之溢出果漿,再吸取鮮濃果漿至無菌離心管中。

      1.3.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

      在無菌條件下,取2m L新鮮百香果果漿涂布于PCA培養(yǎng)基上,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~24 h,挑選單菌落,采用平板劃線法將其純化兩次,獲得目的菌株。

      1.3.3 目標(biāo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

      將目標(biāo)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,于28℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜,菌液室溫條件下8000 r/min離心1min,去掉上清液,取沉淀,采用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA。以其為模板,采用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對(duì)其16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:2×PCRM ix 10.0μL,27F 0.5μL,1492R 0.5μL,模板DNA 1.0μL,雙蒸水(ddH2O)8.0μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;98℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,共循環(huán)30次;72℃再延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序。

      測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center forbiotechnology information,NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性搜索,選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列,采用軟件MEGA6.0中的鄰接(neighborjoining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

      1.3.4 目標(biāo)菌株生長(zhǎng)條件的研究

      培養(yǎng)基的選擇:從平板上挑選目標(biāo)菌株分別接種到pH值為7.0的9.9m LLB液體培養(yǎng)基、不添加瓊脂的PCA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,28℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)10 h。然后按1%(V/V)的接種量接種至對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中,28℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值(OD600nm值)。

      最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定:用無菌接種環(huán)取試管中保存的目標(biāo)菌株1環(huán),接種到LB培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)10 h,測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度值,調(diào)整菌液的OD600nm值為0.6,將其作為種子液。然后將目標(biāo)菌株按1%的接種量接種于不同pH值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的LB液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,測(cè)定OD600nm值。

      最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定:將目標(biāo)菌株按1%的接種量接種于pH值為5.5的LB液體培養(yǎng)基中,然后分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃,200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12h,測(cè)定OD600nm值。

      生長(zhǎng)曲線的測(cè)定:將目標(biāo)菌株按照1%的接種量接種于pH 5.5的LB液體培養(yǎng)基中,在35℃、200 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng),每隔2 h測(cè)定OD600nm值。

      1.3.5 數(shù)據(jù)處理

      采用SPPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;采用Origin 9.1進(jìn)行圖形的繪制。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及鑒定

      2.1.1 形態(tài)觀察

      利用PCA培養(yǎng)基對(duì)百香果果漿中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、純化,得到形態(tài)均一的淺黃色菌落。選取3株特征菌株(編號(hào)為GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19)進(jìn)行菌種鑒定。其在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1A可知,3株細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上的單菌落均為圓形,表面潤(rùn)滑,菌落隆起,菌落呈淺黃色不透明狀。由圖1B可知,3株菌均為短桿型革蘭氏陽性細(xì)菌,菌體長(zhǎng)1.5~2.0μm、寬0.5~0.8μm,兩端鈍圓。絕大多數(shù)單個(gè)存在,也有成串排列。

      圖1 菌株GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的菌落形態(tài)(A)及細(xì)胞形態(tài)(B)Fig.1 Colonialmorphology(A)and cellm orphology(B)of strain GJ2-5,GJ2-13 and GJ2-19

      2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

      分別以菌株GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的基因組DNA為模板,以細(xì)菌鑒定通用引物27F及1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果見圖2。由圖2可知,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均在1 500 bp左右,與預(yù)期結(jié)果相符,送去測(cè)序。

      圖2 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gelelectrophoresis of 16S rDNA PCR products

      圖3 基于16S rDNA序列3株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 3 strains based on 16S rDNA sequences

      百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的16SrDNA序列經(jīng)同源性比對(duì),選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA基因序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。由圖3可知,3株菌均屬于泛菌屬(Pantoea),其中,菌株GJ2-5和GJ2-13均與分散泛菌(Pantoea dispersa)聚于一支,親緣關(guān)系最近,因此,鑒定菌株GJ2-5、GJ2-13為分散泛菌(Pantoeadispersa)。菌株GJ2-19與Pantoea eucrina聚于一支,親緣關(guān)系最近,因此鑒定菌株GJ2-19為Pantoeaeucrina。

      2.2 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)條件的研究

      2.2.1 培養(yǎng)基的選擇

      圖4 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇Fig.4 Selection of grow th medium of endophytic bacteria from passion fruit pulp

      由圖4可知,3株內(nèi)生細(xì)菌在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況均呈現(xiàn)LB培養(yǎng)基>PCA培養(yǎng)基>牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的趨勢(shì),且在LB培養(yǎng)基與PCA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況差異極顯著(P<0.01)。因此,LB培養(yǎng)基更適合用于3株百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)。

      2.2.2 最適生長(zhǎng)pH值的選擇

      圖5 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定Fig.5 Determ ination of optimalgrow th pH of endophytic bacteria from passion fruit pulp

      由圖5可知,該3株內(nèi)生細(xì)菌在pH 4.0~9.0之間生長(zhǎng)良好,其最適pH值均為5.5,但在pH 3.0以下其生長(zhǎng)均受到強(qiáng)烈的抑制。百香果果漿的pH在2.0~3.0之間,說明從百香果果漿中分離到的泛菌具有較強(qiáng)的耐酸性,百香果鮮果果漿可抑制泛菌屬的生長(zhǎng),但不能殺死該泛菌屬。

      2.2.3 最適生長(zhǎng)溫度

      圖6 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定Fig.6 Determ ination of optimalgrow th temperature of endophytic bacteria from passion fruit pulp

      由圖6可知,3株內(nèi)生細(xì)菌在培養(yǎng)溫度為24~40℃之間均呈現(xiàn)良好的生長(zhǎng)狀況,在該范圍內(nèi)其生長(zhǎng)受溫度變化的影響小,屬于中溫型細(xì)菌,且最適生長(zhǎng)溫度均為35℃。但當(dāng)溫度低于24℃之前(或高于40℃之后),其生物量隨著溫度的降低(或溫度的升高)呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05),即在低溫下和在高溫下對(duì)溫度的敏感性明顯增強(qiáng)。

      2.2.4 生長(zhǎng)曲線

      圖7 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線Fig.7 Grow th curves of endophytic bacteria from passion fruit pulp

      由圖7可知,這3株內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致,均在接種后的6h以內(nèi)生長(zhǎng)緩慢,處于適應(yīng)期,該時(shí)期細(xì)菌主要進(jìn)行細(xì)胞分裂必需物質(zhì)的準(zhǔn)備;在6~18h范圍內(nèi)快速生長(zhǎng),處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,主要進(jìn)行細(xì)胞分裂;在18~22h范圍內(nèi)處于平穩(wěn)期,主要進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成;22 h以后進(jìn)入衰亡期。

      3 結(jié)論

      本研究利用PCA培養(yǎng)基從百香果果漿中分離得到3株菌落形態(tài)單一、均呈淺黃色的內(nèi)生細(xì)菌,編號(hào)為GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19,經(jīng)革蘭氏染色,均呈革蘭氏陽性。通過分子生物學(xué)鑒定,鑒定3株內(nèi)生細(xì)菌均為泛菌屬(Pantoea),其中菌株GJ2-5和GJ2-13均為分散泛菌(Pantoea dispersa),菌株GJ2-19為Pantoeaeucrina。同時(shí),對(duì)這3株菌的生長(zhǎng)條件進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,3株內(nèi)生細(xì)菌的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基,最適生長(zhǎng)pH值為5.5,最適生長(zhǎng)溫度為35℃,生長(zhǎng)周期為遲滯期(0~6 h)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(6~18 h)、平穩(wěn)期(18~22 h)和衰亡期(22 h以后)。

      猜你喜歡
      果漿百香果內(nèi)生
      HACCP體系在速凍黃皮果漿生產(chǎn)中的應(yīng)用
      夜空在黑色的果漿里流浪
      金山(2021年6期)2021-07-19 23:13:20
      凍結(jié)方式和凍藏條件對(duì)凍藏水蜜桃果漿品質(zhì)的影響
      保鮮與加工(2021年1期)2021-02-06 06:43:06
      藍(lán)莓果漿品質(zhì)測(cè)定及感官評(píng)價(jià)
      植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
      內(nèi)生微生物和其在作物管理中的潛在應(yīng)用
      落葉在跳舞
      “黨建+”激活鄉(xiāng)村發(fā)展內(nèi)生動(dòng)力
      莫蘭迪的夏天
      五月的一抹新綠
      古蔺县| 普定县| 永德县| 临武县| 西吉县| 舟曲县| 阳信县| 越西县| 闸北区| 怀来县| 法库县| 凤山县| 乌苏市| 新蔡县| 山西省| 黑龙江省| 崇州市| 普陀区| 开封市| 翁牛特旗| 白玉县| 海口市| 大方县| 闵行区| 新津县| 常宁市| 股票| 阳信县| 昔阳县| 化州市| 安仁县| 峨眉山市| 焦作市| 合山市| 义马市| 蛟河市| 新干县| 安化县| 枣强县| 呈贡县| 碌曲县|