甲狀腺微小乳頭狀癌患者血漿microRNA差異表達(dá)譜的研究

章曉芳 丁金旺 詹宇紅 馬麗珍

甲狀腺微小乳頭狀癌和直徑＜1cm的甲狀腺良性結(jié)節(jié)在術(shù)前主要依靠B超以及甲狀腺細(xì)針穿刺鑒別。由于甲狀腺乳頭狀癌（PTC）B超的影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，而細(xì)針穿刺由于結(jié)節(jié)較小、得到的細(xì)胞數(shù)量較少難以確診PTC。循環(huán)miRNA存在于外周血中，大規(guī)模的臨床研究表明檢測患者循環(huán)miRNA可以鑒別多種良惡性腫瘤[1]，因此有望成為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物。本研究通過miRNA測序法篩選出甲狀腺微小乳頭狀癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者外周血中差異表達(dá)的miRNA，并對其生物信息學(xué)內(nèi)容進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探討miRNA在甲狀腺微小乳頭狀癌早期診斷中的作用提供幫助。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017年3至7月我院腫瘤外科收治的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，經(jīng)術(shù)后病理診斷為甲狀腺微小乳頭狀癌和甲狀腺良性結(jié)節(jié)（直徑＜1cm）各5例，兩組均為男2例，女3例，平均年齡分別為42歲和49歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)以及所有標(biāo)本的獲取均經(jīng)患者同意并簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集 兩組患者入院時即抽取外周靜脈血5ml于EDTA抗凝管中，混勻后即置于4℃或冰盒中保存，并于1h內(nèi)進(jìn)行血漿分離；1 500r/min離心10min后得到上層血漿；將血漿轉(zhuǎn)移至1.5ml無RNA酶（RNase free）中，每個管子吸入200μl血漿進(jìn)行分離，棄去沉淀的血細(xì)胞；將分裝好的血漿置于-80℃保存。

1.3 血漿總RNA提取及質(zhì)量檢測 使用TRIzol LS Reagent分離提取總RNA，使用NanoDrop ND-1000測定RNA濃度和純度。本研究RNA提取以及質(zhì)量檢測、測序、數(shù)據(jù)分析均委托上?？党缮镞M(jìn)行，10例樣本RNA濃度和純度均達(dá)到后續(xù)試驗的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 miRNA測序 按照Illumina NextSeq 500儀器說明書中的步驟進(jìn)行測序。首先使用每個樣品的總RNA制備miRNA測序文庫，然后將文庫變性為單鏈DNA分析，在illumina flow cell上進(jìn)行捕獲，原料擴(kuò)增為簇，在測序儀上進(jìn)行50個cycle測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析 測序完成后，使用Solexa CHASTITY質(zhì)控篩選原始Reads得到Clean Reads。將Clean Reads去接頭，并留下長度≥15nt的tag得到trimmed Reads。然后，使用 Novoalign 軟件（v2.07.11）將 trimmed Reads比對到合并的pre-miRNAs數(shù)據(jù)庫上（miRBase v21 pre-miRNAs），最多允許1處錯配。在計算miRNA表達(dá)的時候，數(shù)量＜2的Reads被舍棄。為了表征異構(gòu)體的變化，成熟體區(qū)域±4nt的Reads被當(dāng)作成熟miRNA的異構(gòu)體，并且根據(jù)在前體發(fā)卡的位置分為5P類和3P類。統(tǒng)計比對到每條成熟miRNA區(qū)域（±4nt）上的Reads數(shù)作為該miRNA的原始表達(dá)量，并使用TPM（tag counts per million miRNA alignments）對樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；跇?biāo)準(zhǔn)化的所有miRNA異構(gòu)體的tag數(shù)，對實驗計算兩組樣品（有重復(fù)）間的P值和倍數(shù)變化，并根據(jù)P值和倍數(shù)變化篩選差異miRNAs。計算兩個樣品（沒有重復(fù)）間的倍數(shù)變化，并根據(jù)倍數(shù)變化篩選差異miRNAs。

1.6 聚類圖和靶基因預(yù)測以及生物信息學(xué)分析 采用mirdbV5和TaregetScan7.1對差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，并運用Gene Ontology（GO）分析和KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫富集靶基因以初步分析其功能。GeneR-atio是該GO Term相關(guān)的基因數(shù)與整個差異基因總數(shù)的比值。該值越大代表該GO Term的意義越大。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者差異表達(dá)的miRNA miRNA測序時選取增加倍數(shù)為1.3倍，降低倍數(shù)為0.77倍，將P≤0.05的miRNA作為差異表達(dá)的miRNA。結(jié)果顯示甲狀腺微小乳頭狀癌較甲狀腺良性結(jié)節(jié)表達(dá)量增加的miRNA 3個，減少的miRNA 8個，見表1、2。將這些差異miRNA進(jìn)行聚類分析如圖1所示（見插頁）。

圖1 甲狀腺微小乳頭狀癌和甲狀腺良性結(jié)節(jié)差異miRNA聚類圖（PTMC：甲狀腺微小乳頭狀癌；BN：甲狀腺良性結(jié)節(jié)）

表1 甲狀腺微小乳頭狀癌較甲狀腺良性結(jié)節(jié)表達(dá)量增加的miRNA

表2 甲狀腺微小乳頭狀癌較甲狀腺良性結(jié)節(jié)表達(dá)量減少的miRNA

2.2 靶基因預(yù)測 通過 mirdbV5和 TaregetScan7.1對差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。上調(diào)的3個差異miRNA通過mirdbV5預(yù)測共有201個靶基因，通過TaregetScan7.1預(yù)測共有412個靶基因，兩者交集靶基因為76個。下調(diào)的8個差異miRNA通過mirdbV5預(yù)測共有1 145個靶基因，通過TaregetScan7.1預(yù)測共有1 057個靶基因，兩者交集靶基因為298個。選取兩個軟件共同預(yù)測到的靶基因進(jìn)一步進(jìn)行GO和KEGG分析。

2.3 GO分析靶基因的生物學(xué)功能預(yù)測結(jié)果 GO分析共有3種分析方法，生物學(xué)過程（biology process，BP），細(xì)胞組分（cell compontent，CC）和分子功能（molecular function，MF）。本研究主要進(jìn)行BP分析。圖2（見插頁）顯示的是上調(diào)miRNA預(yù)測到的差異基因進(jìn)行GO分析得到的前10個GO Term，提示蛋白質(zhì)修飾和細(xì)胞分解代謝可能與甲狀腺微小乳頭狀癌發(fā)生相關(guān)。下調(diào)的miRNA預(yù)測到差異基因進(jìn)行GO分析提示代謝過程和生物合成過程可能與甲狀腺微小乳頭狀癌相關(guān)（圖3，見插頁）。

圖2 上調(diào)miRNA靶基因參與的GeneRatio前10 GO term[GeneRatio：GO Term相關(guān)的基因數(shù)（Count）與整個差異基因總數(shù)（List Total）的比值]

圖3 下調(diào)miRNA靶基因參與的GeneRatio前10 GO term[GeneRatio：GO Term相關(guān)的基因數(shù)（Count）與整個差異基因總數(shù)（List Total）的比值]

2.4 差異miRNA靶基因KEGG信號通路預(yù)測結(jié)果 由于上調(diào)miRNA數(shù)量較少，KEGG數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果提示只有一條信號通路即RNA降解與甲狀腺微小乳頭狀癌相關(guān)，參與的基因為PAPD5和TOB1，相關(guān)miRNA分別為hsa-miR-532-3p和hsa-miR-636。下調(diào)miRNA靶基因通過KEGG分析提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工以及HIF-1信號通路可能參與PTMC發(fā)生。下調(diào)miRNA靶基因參與的GeneRatio前10的信號通路圖4（見插頁）。

圖4 下調(diào)miRNA靶基因參與的GeneRatio前10 Pathway term[GeneRaio:Pathway Term相關(guān)的基因數(shù)（selection Count）與差異基因總數(shù)(selection size)的比值]

3 討論

隨著頸部超聲檢查的廣泛應(yīng)用，甲狀腺結(jié)節(jié)在普通人群中的發(fā)病率非常普遍，呈逐年上升的趨勢[2]。大部分的甲狀腺結(jié)節(jié)為良性結(jié)節(jié)，只有5%～10%的結(jié)節(jié)為惡性，且惡性結(jié)節(jié)中90%是甲狀腺乳頭狀癌[3]。甲狀腺乳頭狀癌采取手術(shù)治療，而良性甲狀腺結(jié)節(jié)采取定期隨訪的原則[4]。目前甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前良惡性的判斷主要依靠高頻超聲，但是目前沒有非常特異的B超影像特征可以診斷PTC[5]。在有條件的醫(yī)院開展了B超引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺，該項技術(shù)目前是甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[6]，具有較高的靈敏度和特異度[7]。由于細(xì)針穿刺技術(shù)常受限于甲狀腺結(jié)節(jié)的大小，穿刺抽取細(xì)胞數(shù)以及血液的污染，以及患者的接受程度，導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)診斷仍不能確診PTC。因此非常有必要發(fā)現(xiàn)一種無創(chuàng)的，且靈敏度和特異度較高的、操作簡單的方法早期診斷PTC，為臨床醫(yī)生定制治療方案提供可靠依據(jù)。

miRNA是一種小的、非蛋白質(zhì)編碼RNA，通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制目的mRNA的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8]。miRNA參與細(xì)胞的增值、分化、凋亡、黏附和腫瘤細(xì)胞的整個發(fā)生過程。miRNA在人類多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，包括甲狀腺腫瘤[9-10]。大量的研究表明在甲狀腺乳頭狀癌患者和正常人之間存在差異表達(dá)的miRNA。盡管這些數(shù)據(jù)表明miRNA可能是一個鑒別良惡性腫瘤的重要指標(biāo)，但是缺陷在于只能在術(shù)后手術(shù)切除標(biāo)本中進(jìn)行檢測，不能作為一個早期診斷標(biāo)記用于指導(dǎo)臨床。

循環(huán)中的miRNA存在于血液中，對RNA酶耐受，因此非常容易檢測，操作簡便且可靠性較高。目前關(guān)于miRNA的來源不是非常明確，可能來由腫瘤細(xì)胞釋放而來，也可能為免疫細(xì)胞釋放，凋亡或者壞死的腫瘤細(xì)胞釋放等多種途徑而來。大規(guī)模的臨床研究證明在多種腫瘤包括甲狀腺腫瘤中循環(huán)miRNA可以鑒別良惡性腫瘤，有望成為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志[10]。

目前關(guān)于血清miRNA在甲狀腺腫瘤中的研究目前有4篇影響力較大的報道，2012年我國學(xué)者首次通過Solexa sequencing方法發(fā)現(xiàn) let-7e、miRNA-151-5P和miRNA-222在PTC中較良性甲狀腺結(jié)節(jié)和正常人均增高，且與PTC的TNM分期和腫瘤大小有關(guān)[11]。2014年意大利學(xué)者報道了白種人PTC血清miRNA-95和miRNA190均較正常人和甲狀腺結(jié)節(jié)增高，但該研究未發(fā)現(xiàn)差異miRNA與PTC臨床特征如腫瘤大小，TNM分期有相關(guān)性[12]。2017年該團(tuán)隊擴(kuò)大樣本量，在1 000例患者中進(jìn)一步驗證了這兩個miRNA在甲狀腺乳頭狀癌早期診斷中的意義，研究發(fā)現(xiàn)miRNA-190 and-95聯(lián)合甲狀腺細(xì)針穿刺技術(shù)可以明顯提高術(shù)前甲狀腺乳頭癌的診斷（靈敏度為96.3%）[13]。而在2015年我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)PTC血清中miR-25-3P和miR-451a較正常人和良性甲狀腺結(jié)節(jié)患者含量增高，但該研究未分析差異的miRNA與PTC臨床特征的相關(guān)性[14]。2016年來自中國學(xué)者發(fā)現(xiàn) miR-124-3p、miR-9-3p、miR-4701和 miR-196b-5p在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性結(jié)節(jié)外周血中具有明顯差異[15]。

鑒于以上結(jié)果的不一致性，本研究采用Illumina NextSeq 500測序儀進(jìn)行miRNA測序分析，結(jié)果提示甲狀腺微小乳頭狀和甲狀腺良性結(jié)節(jié)miRNA表達(dá)存在明顯差異，11個差異表達(dá)的miRNA與其他研究結(jié)果不一致，這可能與選取的樣本有關(guān)，本研究選取甲狀腺微小乳頭狀癌以及直徑＜1cm的良性結(jié)節(jié)，而其他研究大多選取甲狀腺乳頭狀癌，沒有規(guī)定大小。miRNA-181與黑色素瘤、急性白血病、非小細(xì)胞肺癌均有關(guān)[16-18]。本研究首次發(fā)現(xiàn)甲狀腺微小乳頭狀癌miRNA較甲狀腺良性結(jié)節(jié)表達(dá)減少，提示miRNA-181可能參與甲狀腺微小乳頭狀癌的發(fā)生，為術(shù)前進(jìn)一步明確診斷甲狀腺微小乳頭狀癌提供實驗室依據(jù)。miR-30a在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)減少，通過促進(jìn)IGF-1R促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的增值，遷移以及上皮細(xì)胞間質(zhì)變[19]。本研究在PTMC血漿中檢測到miR-30a的含量較低，提示血漿miR-30a可能為鑒別良惡性的指標(biāo)之一。miRNA-139通過增強(qiáng)fibronectin 1表達(dá)促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的增值和侵襲[20]，與本研究結(jié)果相似，這提示血漿miRNA-139可能為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別指標(biāo)之一。盡管經(jīng)過文獻(xiàn)查閱提示miR-181、miR-30a、miR-139在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)量減少，與本研究相似，但這3種miRNA能否進(jìn)一步作為甲狀腺乳頭狀癌術(shù)前診斷的指標(biāo)之一，仍需我們擴(kuò)大樣本進(jìn)一步證實。

通過KEGG分析差異miRNA靶基因的信號通路，提示HIF-1信號通路可能參與甲狀腺微小乳頭狀癌的發(fā)生，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相似，HIF-1與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，包膜轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)[21-22]。

甲狀腺微小乳頭狀癌和甲狀腺良性結(jié)節(jié)miRNA表達(dá)譜存在明顯差異，血漿miR-181、miR-30a、miR-139能否作為術(shù)前鑒別甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的指標(biāo)，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗證。盡管樣本數(shù)比較少，仍為進(jìn)一步探討miRNA在微小乳頭狀癌的早期診斷提供理論依據(jù)和思路。