CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑處理對南美白對蝦的保鮮效果

蔡燕萍,張莎莎,劉建華,丁玉庭,3,劉書來,3,*

(1.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,浙江杭州 310014;2.國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州),浙江杭州 310014；3.浙江工業(yè)大學(xué)海洋研究院,浙江杭州 310014)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)又名凡納濱對蝦[1],是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的三大蝦類之一,其肉質(zhì)鮮美,高蛋白,低脂肪,備受消費(fèi)者青睞。由于微生物極易繁殖,導(dǎo)致蝦的鮮度品質(zhì)下降;而蝦體內(nèi)酶的酶促反應(yīng)致使蝦表面出現(xiàn)黑斑,嚴(yán)重降低南美白對蝦的食用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值,開發(fā)一種安全、有效的保鮮技術(shù),以延長南美白對蝦的保鮮期,顯得尤為重要。

近年來,大量的研究報道了蝦類的保鮮方法,主要包括物理保鮮(低溫、超高壓、酸性電解水[2]、氣調(diào)[3]、輻照等)、化學(xué)保鮮(化學(xué)保鮮劑、臭氧等)和生物保鮮(多酚、殼聚糖及各類生物提取物[4]等)[5]。物理保鮮普遍存在操作復(fù)雜、成本高、安全性不明確等因素,其推廣使用有一定的困難。生物保鮮劑在生物中含量較低,其獲取成本高,操作復(fù)雜,目前仍主要停留于實驗室水平[6-7]。化學(xué)保鮮簡單高效、成本低廉,但鑒于其在食品中殘留量方面的安全性考慮,可將化學(xué)保鮮與其他保鮮方式結(jié)合使用,CO2和冷海水技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于南美白對蝦保鮮在國內(nèi)外鮮有報道。本實驗以南美白對蝦為研究對象,利用CO2冷海水與抗氧化劑相結(jié)合浸泡處理,旨在探究南美白對蝦的貯藏品質(zhì),篩選適合于南美白對蝦的抗氧化劑,以達(dá)到最佳的保鮮效果,以期為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ),為水產(chǎn)行業(yè)提供新的保鮮方法和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦 購于杭州德勝市場,蝦長11.5±0.5 cm,重9.0±1.5 g,將鮮活蝦?；钸\(yùn)至實驗室,剔除死亡個體,選擇大小均勻、鮮活無損傷個體;Tris、鉬酸銨、亞硫酸氫鈉、對甲基酚硫酸鹽、三氯乙酸、馬來酸、ATP鈉鹽等 均為分析純,國藥集團(tuán)試劑公司;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)、次黃嘌呤(Hx)等 均為色譜純,Sigma公司。

DLSB-2050低溫冷卻槽 杭州市大衛(wèi)科技有限公司;LDZX-40BI型自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安器械廠;Waters2695高效液相色譜儀 美國waters公司;PHS-3C型數(shù)顯酸度計、752 N型紫外可見分光光度計 上海精科儀器有限公司;海廚SK2166高速組織搗碎機(jī) 上海賽康電器有限公司;TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)有限公司;DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;TAXT Plus 物性儀 英國Stable Micro System公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CO2冷海水發(fā)生裝置 如圖1所示,在低溫冷卻槽中將人工海水(含鹽量為3.3%)冷卻至4 ℃,將冷海水經(jīng)水泵灌入氣液混合罐,通入CO2與冷海水混合,維持一定壓力和時間,至CO2的濃度飽和,即為飽和CO2冷海水。通過15～20 min的氣液混合后可以達(dá)到平衡,平衡壓力為0.2 MPa,CO2濃度為0.533%[8]。

圖1 CO2冷海水發(fā)生裝置示意圖

1.2.2 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑處理南美白對蝦 飽和CO2冷海水中分別作如下處理:a. 未添加抗氧化劑組(對照組);b.添加抗氧化劑組(處理組):添加2% 4-己基間苯二酚(4-己基間苯二酚組);添加2%植酸(植酸組);添加2%葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組)。將鮮活蝦分別浸泡于以上四種飽和CO2冷海水中,24 h后取出,4 ℃貯藏,間隔2 d(0、2、4、6、8、10 d)取樣分析。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 菌落總數(shù)測定 采用GB/T 4789.2-2016的方法。菌落總數(shù)的測定采用平板計數(shù)法。以lg CFU/g蝦肉報告實驗數(shù)據(jù),菌落總數(shù)用TBC表示。

1.2.3.2 揮發(fā)性鹽基氮測定 采用GB 5009.228-2016中的半微量凱氏定氮法測定。

1.2.3.3 K值測定 核苷酸關(guān)聯(lián)物的提取:采用王遠(yuǎn)紅等的方法[9],具體操作如下:取5.0 g 蝦肉勻漿,加入15 mL 預(yù)先冷卻至4 ℃的10%的高氯酸(PCA)溶液進(jìn)行抽提,懸浮液離心(3000×g,10 min),收集上清液。所得沉淀再用5%PCA 溶液抽提后離心。合并兩次上清液,用10 mol/L KOH 溶液將其中和至pH6.5～6.8,定容至50 mL,然后用孔徑為0.45 μm濾膜過濾。濾液在-18 ℃下保存,供測定用。

液相色譜法測定K值:采用Ryder[10]的方法,并稍作修改。使用Waters 2695高效液相色譜儀,色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為0.05 mol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液,流速1 mL/min,檢測波長254 nm,進(jìn)樣量10 μL。以外標(biāo)法定量;ATP及其降解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品為:ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99.0%,測得的HxR、Hx量之和與ATP及其降解產(chǎn)物總量的百分比即為鮮度指標(biāo)K值。

1.2.3.4 多酚氧化酶測定 多酚氧化酶(PPO)粗酶液的提取:采用陳魯萍等方法[11]。稱取10 g蝦頭,剪碎,加入25 mL預(yù)冷至4 ℃的0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.2,含1 mol/L NaCl和0.2%的Brij-35 聚環(huán)氧乙烯月桂酰醚),勻漿,提取液4 ℃攪拌抽提3 h,離心(4 ℃,10000 r/min,30 min),取上清液重復(fù)離心(參數(shù)同上)一次,棄沉淀,上清液即為PPO粗酶液。

PPO活力的測定:取0.05 mol/L、pH7.2的磷酸緩沖溶液4 mL,加入50 mmol/L鄰苯二酚溶液1 mL,于30 ℃水浴中預(yù)熱10 min。加入PPO粗酶液1 mL,搖勻后在波長410 nm處比色測定。酶液加入后開始計時,每30 s記錄一次吸光度A隨時間的變化值,以5 min內(nèi)最初直線段的斜率(ΔA/t)計算酶活力。對照組中以蒸餾水代替粗酶液。重復(fù)測定6 次取其平均值。

式中,Y為不同抑制劑處理后蝦頭PPO活力,X為新鮮蝦頭中PPO活力。

1.2.3.5 感官評價 參考楊鐘燕等[12]的方法。感官評定小組由5名感官敏銳并具有感官評定經(jīng)驗的人員組成,總分值在9分(極新鮮)和0分(完全腐敗)之間,從肉質(zhì)、外觀、氣味等方面進(jìn)行評分,具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1,結(jié)果以三項總分計。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sensory evaluation

1.2.3.6 pH測定 采用GB 5009.237-2016食品pH的測定。將對蝦去頭、殼,用高速組織搗碎機(jī)搗碎,稱取絞碎的肉5.0 g,加10倍體積煮沸冷卻的蒸餾水搖勻,抽提30 min,過濾后用PHS-3C型數(shù)顯酸度計測定濾液的pH。

1.2.3.7 剪切力測定 采用Brauer等[13]的方法。取處理后的南美白對蝦,去頭、去尾、去殼,剪切力測定需要切斷蝦尾前的第一段,因此將蝦肉與剪切刀頭垂直放置于樣品平臺上,刀頭的下降速度為50 mm/min,記錄圖譜上的第一個主尖峰(通常是最高峰,代表剪切樣品所需要的最大剪切力)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析與結(jié)果繪圖分別采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差分析采用Duncan法,顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑對菌落總數(shù)的影響

菌落總數(shù)(TBC)是評價食品腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)之一,當(dāng)TBC≤5 lg(CFU/g)為一級鮮度,≤5.7 lg(CFU/g)為二級鮮度,而菌落總數(shù)超過6 lg(CFU/g)時已不能食用,以此判定蝦的貨架期終點(diǎn)[14]。圖2 為不同抗氧化劑對菌落總數(shù)的影響。從圖2可以看出,鮮活南美白對蝦的菌落總數(shù)為5 lg(CFU/g),冷藏至第2 d,處理組與對照組相比,菌落總數(shù)無顯著差異(p>0.05),三個處理組的菌落總數(shù)呈現(xiàn)略微降低的趨勢。這可能是由于貯藏初期,蝦浸泡于CO2冷海水環(huán)境中,體內(nèi)的嗜溫菌在低溫和CO2冷海水共同作用而部分死亡[15];同時處理組中抗氧化劑的添加也抑制了微生物的生長繁殖。貯藏2 d后,對照組和處理組的TBC均呈現(xiàn)增長趨勢,處理組的增長速度慢于對照組(p<0.05)。貯藏后期,對照組中微生物大量繁殖,而添加抗氧化劑的處理組均存在不同程度的抑菌效果,第8 d時植酸組、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組的菌落總數(shù)分別達(dá)到5.29、5.38 lg(CFU/g);4-己基間苯二酚組在第6 d接近5.51 lg(CFU/g),而對照組在第8 d就已超過二級鮮度。貯藏10 d后,4-己基間苯二酚組、植酸組、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組的菌落總數(shù)分別達(dá)到5.99、5.78、5.82 lg(CFU/g),均已超過二級鮮度。由此可知,抗氧化劑在CO2冷海水中的應(yīng)用可以明顯抑制微生物生長,使貨架期在原有的基礎(chǔ)上延長2 d左右,且植酸組、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組優(yōu)于4-己基間苯二酚組。

圖2 不同抗氧化劑對菌落總數(shù)的影響

2.2 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑對揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的影響

根據(jù)GB 2733-2015規(guī)定:海水魚蝦的TVB-N含量≤30 mg/100 g。圖3給出了貯藏期內(nèi)南美白對蝦TVB-N的變化趨勢。新鮮南美白對蝦TVB-N含量為9.7 mg/100 g。貯藏2 d以內(nèi)處理組的TVB-N變化不大,均為一級鮮度,這與微生物變化趨勢呈一致性。隨著貯藏時間延長,各組TVB-N含量均顯著增加(p<0.05),這與Li等[16]的研究結(jié)果一致。而處理組從貯藏2 d開始直至貯藏末期均顯著低于對照組(p<0.05)。貯藏4 d后植酸組、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組TVB-N的增長速度顯著低于4-己基間苯二酚組(p<0.05)。貯藏第8 d時對照組超過二級鮮度,而4-己基間苯二酚組、植酸組、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組的TVB-N分別為20.01、17.06、17.84 mg/100 g(p>0.05),貯藏10 d時接近二級鮮度。由圖2、圖3可知,TVB-N變化與菌落總數(shù)變化呈正相關(guān)性。這就說明植酸和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯更適合于南美白對蝦的保鮮處理,CO2冷海水中添加抗氧化劑在降低微生物生長繁殖的同時,能顯著抑制南美白對蝦TVB-N的生成。

圖3 不同抗氧化劑對揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的影響

2.3 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑對K值的影響

K值表示核苷酸的自溶降解程度,也是最靈敏的蝦鮮度指標(biāo)。K值越大,表明海產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)等分解越嚴(yán)重,其鮮度越差。一般認(rèn)為,K值≤20%時為一級鮮度,20%～40%為二級鮮度,超過60%為初期腐敗[16-17]。圖4為不同抗氧化劑對K值的影響。由圖4可知,K值在貯藏過程中呈上升趨勢。貯藏4 d后4-己基間苯二酚組、植酸組、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組的K值與對照組差異顯著(p<0.05)。三個處理組保持一級鮮度的時間均比對照組延長2 d,其中植酸組、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組的保鮮效果優(yōu)于4-己基間苯二酚組。這與三種抗氧化劑的作用原理有關(guān),4-己基間苯二酚是蝦蟹中公認(rèn)的抗黑變劑[19],是多酚氧化酶的有效抑制劑[20]。植酸和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯依靠其競爭性抑制或螯合金屬離子,減弱內(nèi)源酶的水解作用[20-21]。同時,植酸組和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組之間差異不顯著(p>0.05)。貯藏4 d時對照組K值達(dá)到20.57%,超出一級鮮度;而處理組在貯藏6 d后超出一級鮮度;由圖4可知,對照組在貯藏8 d時K值達(dá)到68.68%;超出二級鮮度;而三處理組的K值均在貯藏10 d達(dá)到60%以上,這與TVB-N和菌落總數(shù)的變化呈現(xiàn)正相關(guān)性。三種抗氧化劑與CO2冷海水的抑菌效果可知,植酸組和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組可以維持蝦的新鮮程度在較好的范圍內(nèi),4-己基間苯二酚組的效果次之。

圖4 不同抗氧化劑對K值的影響

2.4 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑對多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶(PPO)催化的酶促反應(yīng)導(dǎo)致蝦死后發(fā)生褐變,引起其感官品質(zhì)下降,因此在評價保鮮效果時,多酚氧化酶活性的變化可作為重要的評價指標(biāo)之一[23]。圖5為不同抗氧化劑對多酚氧化酶相對活性(PPO)的影響。由圖5可知,貯藏2 d后,所有樣品組的PPO相對酶活性均逐漸降低(p<0.05),這主要是由于所處環(huán)境的pH所致。pH的變化顯著地影響酶-底物是否可以順利進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng),因此低pH環(huán)境會降低酶的活性和褐變程度。貯藏2～4 d,三個處理組的相對酶活性下降程度顯著快于對照組(p<0.05),這主要是由于抗氧化劑的添加加速了多酚氧化酶活性的下降[24],但三處理組的下降速度不同,這與不同抗氧化劑的抑酶活性有關(guān)。由圖5中可知,貯藏2～6 d葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組和植酸組抑酶效果優(yōu)于4-己基間苯二酚組;而在貯藏6 d至貯藏末期,三處理組差異性不顯著(p>0.05),且多酚氧化酶相對酶活性保持穩(wěn)定。

圖5 不同抗氧化劑對多酚氧化酶相對活性(PPO)的影響

2.5 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑對感官品質(zhì)的影響

南美白對蝦經(jīng)不同抗氧化劑處理后,感官品質(zhì)的變化如圖6所示。由圖6可知,隨著貯藏時間的延長,南美白對蝦的肉質(zhì)與蝦殼逐漸變軟,體表出現(xiàn)黑斑,腐敗氣味增強(qiáng),對照組、4-己基間苯二酚組、植酸組和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組南美白對蝦的感官評分在貯藏期間均逐漸降低,且抗氧化劑處理組均顯著優(yōu)于對照組(p<0.05),植酸處理組的感官評分下降趨勢最平緩。貯藏6 d時,對照組出現(xiàn)腐敗氣味,蝦殼變軟,色澤變暗,表面出現(xiàn)少量黑斑。對照組貯藏8 d時,出現(xiàn)較強(qiáng)腐敗氣味,蝦體肉與殼連接松弛,蝦頭出現(xiàn)大面積黑斑,而三個處理組貯藏10 d時,蝦體才出現(xiàn)黑斑,有腐敗氣味,且植酸處理組的黑變最少。因此,CO2冷海水結(jié)合4-己基間苯二酚、植酸和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的添加有助于延緩南美白對蝦感官品質(zhì)的下降。

圖6 不同抗氧化劑對感官品質(zhì)的影響

2.6 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑對pH的影響

圖7為不同抗氧化劑對pH的影響。由圖7可知,新鮮南美白對蝦的pH為6.93,與其他文獻(xiàn)報道有所不同,這可能與南美白對蝦產(chǎn)地環(huán)境和成熟季節(jié)的差異有關(guān)。貯藏過程中pH呈現(xiàn)上升趨勢,這是由于貯藏時間延長,微生物繁殖,產(chǎn)生了TVB-N和TMA等堿性化合物。Shamshad等[25]研究認(rèn)為,蝦體pH和鮮度有很好的相關(guān)性,并指出pH7.8是區(qū)分品質(zhì)可否接受的關(guān)鍵點(diǎn),因此檢測蝦貯藏期內(nèi)的pH變化能間接反映蝦品質(zhì)變化。對照組pH上升速度最快,在第8 d時pH接近7.8,已不可食用;而4-己基間苯二酚組、植酸組和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯組的pH變化差異不顯著(p>0.05),均在第10 d達(dá)到7.8,處理組的貨架期比對照組延長了2 d左右。這說明4-己基間苯二酚、植酸和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的添加抑制了微生物的生長,減緩了蝦肉品質(zhì)的降低。

圖7 不同抗氧化劑對pH的影響

2.7 CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑對質(zhì)構(gòu)的影響

各樣品組在貯藏期間剪切力變化如圖8所示。由圖8可知,南美白對蝦的剪切力隨著貯藏時間的延長,呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。貯藏開始時蝦體的剪切力均為17.15 N,隨著貯藏時間的延長,對照組和三處理組的蝦體剪切力均下降,這可能是由于貯藏期間蝦體內(nèi)源性酶、微生物源蛋白水解酶和膠原酶對蝦體的分解作用所致[26]。三處理組的下降速度均比對照組慢,第10 d時對照組剪切力顯著低于處理組(p<0.05),三處理組之間差異不顯著(p>0.05)。

圖8 不同抗氧化劑對剪切力的影響

3 結(jié)論

貯藏過程中抗氧化劑添加對南美白對蝦均有較好的保鮮效果。添加4-己基間苯二酚、植酸、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的蝦體,其菌落總數(shù)、TVB-N含量、K值、pH的增加速度明顯低于對照組,多酚氧化酶活性受到抑制,各樣品組的質(zhì)構(gòu)無明顯差異。與對照組相比,CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑處理后的南美白對蝦貨架期延長2 d。抗氧化劑的添加強(qiáng)化了CO2冷海水的保鮮效果,其中以植酸、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的效果為佳。該研究提出的CO2冷海水結(jié)合抗氧化劑的鮮技術(shù)可有效減緩南美白對蝦的腐敗變質(zhì),延長其貨架期。今后可考慮進(jìn)一步優(yōu)化植酸和葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的添加量、處理時間和貯藏溫度等條件,從而獲得最佳的南美白對蝦保鮮方式。