甜菜紅素提取、純化、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究進展

肖默艷,黃燕芬,王東偉,趙 雷,王 凱,胡卓炎

(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

甜菜紅色素是世界上廣泛使用的一種食用天然色素,包括紅色的甜菜紅素(Betacyanin)和黃色的甜菜黃素(Betaxanthin)兩大類,存在于莧科、藜科、紫茉莉科、仙人掌科以及商陸科等多種植物中。其中藜科最為人們熟悉的是紅甜菜,莧科葉子花屬的葉子花、馬齒莧的花瓣,仙人掌科植物中仙人掌果實、火龍果果皮和果肉、商陸科的商陸漿果、雞冠花等也均含有豐富的甜菜紅素[1]。

甜菜紅素的名字來源于紅甜菜的拉丁語(Betavulgaris),其最早在1938年由Pucher等[2]從紅甜菜根中制備出來。1958年之前,甜菜紅素一直被認為是花青素或含氮花青素,隨后研究表明該色素不同于花青素[3]。

近年來因化學合成食用色素的安全性問題,其使用已逐漸受限,而天然色素則具有安全性高且兼有營養(yǎng)功能的特點,其研發(fā)與應用成為關(guān)注熱點。甜菜紅素的基本結(jié)構(gòu)中包含一個葡糖苷化的酚羥基和環(huán)胺基團,是良好的電子供體,能夠通過直接清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應、絡合金屬離子、抑制氧化酶和炎癥因子的表達以及激活機體抗氧化體系等方面發(fā)揮抗氧化作用?；谇叭说难芯抗ぷ?本文對甜菜紅素的結(jié)構(gòu)及其提取純化、穩(wěn)定性等方面的研究進展進行綜述,為甜菜紅素的研究與應用提供參考。

1 甜菜紅素的主要成分、化學結(jié)構(gòu)和分布情況

甜菜紅素(Betalanin)是水溶性含氮色素,從化學結(jié)構(gòu)(圖1)上看,它的基本結(jié)構(gòu)是吡啶衍生物甜菜醛氨酸(Betalamic acid)和仲胺的縮合物[4],基本發(fā)色基團是1,7-二偶氮庚甲堿。甜菜紅素結(jié)構(gòu)中取代基與1,7-二偶氮庚甲堿共振,化合物顏色為紅色,在538 nm處有最大吸收[5]。

圖1 甜菜紅素基本結(jié)構(gòu)

甜菜紅素(Betacyanin)是在甜菜配基(Betanidin)上連接不同取代基的混合物,主要取代情況如表1所示。能與甜菜配基形成糖苷的糖僅有葡萄糖和葡萄醛酸,且附著在C6的效率要低于C5,C5葡萄糖基化后的物質(zhì)即為甜菜苷(Betanin),糖基化產(chǎn)物的最大吸收波長均向紫光轉(zhuǎn)移[6]。甜菜苷糖基上也能有丙二酸或3-羥基-3-甲基戊二酸取代成酰化物,?；笫蛊渥畲笪詹ㄩL紅移[7]。此外,甜菜苷分子中C15為不對稱碳原子,存在差向異構(gòu)體,異構(gòu)體兩兩之間易發(fā)生相互轉(zhuǎn)換[8]。

表1 甜菜紅素的主要取代模式、命名及分布

不同種類植物中甜菜紅素的組成和含量有所差異。在藜科植物紅甜菜中甜菜苷(Betanin)及其異構(gòu)體異甜菜苷(Isobetanin)占甜菜紅素的75%～95%,其余色素所占比例較少[9]。仙人掌科植物的花朵和果實中僅含有27%～30%的甜菜苷,而葉蠟素(Phyllocactin)和異基素(Isophyllocactin)是其特征色素,占甜菜紅素總量的45%～55%[10],其余尚含有15%～20%的hylocerenin和isohylocerenin[11]。莧屬植物中主要含有莧菜紅苷(Amaranthin)及其異構(gòu)體異莧菜紅苷(Isoamaranthin),其中莧菜紅苷占80%左右,異莧菜紅苷占20%左右,而基本不含其它甜菜紅素類色素[12]。千日紅素(Gomphrenin)與甜菜苷的區(qū)別在于R3和R4上取代模式相反,且千日紅素主要存在于千日紅花朵中[13]。

2 甜菜紅素提取技術(shù)

2.1 溶劑提取法

溶劑提取法是利用原料中組分在不同溶劑中溶解度差異,實現(xiàn)提取分離的方法。甜菜紅素具有親水性,易溶于水和與水互溶的有機溶劑中[1]。余莉莉[14]用35%乙醇浸提火龍果果皮色素,最佳提取條件是調(diào)整溶液pH至4.0,料液比1∶8 (W/V),提取溫度為30 ℃。袁亞芳等[15]用30%乙醇浸提火龍果果皮粉中的甜菜紅素,最佳提取條件為調(diào)整溶液pH至6.5,30 ℃下提取75 min,提取率僅為4.56 mg/100 g。此外,還有其他學者提取了紅甜菜、鹽地堿蓬和雞冠花等中的甜菜紅素,因原料不同,最佳提取工藝及提取效果也不同?？傊?溶劑提取法所用溶劑價格較低、提取溫度較溫和、操作簡單。但此法提取甜菜紅色素耗時較長,所得產(chǎn)品雜質(zhì)較多、提取率較低、純度不高。

2.2 超聲波輔助提取法

超聲波可與媒質(zhì)產(chǎn)生熱作用、機械作用和空穴作用,在一定程度上破壞細胞壁結(jié)構(gòu),使細胞內(nèi)物質(zhì)快速溢出[16]。已有諸多學者利用超聲波提取甜菜紅素(見表2),此外,還有部分學者對比研究了超聲波輔助提取和傳統(tǒng)溶劑提取法的提取效果,周俊良等[17]發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取甜菜紅素的提取率較溶劑提取法高0.42%;藍培基等[18]發(fā)現(xiàn)提取條件相同時,超聲波提取所得色素提取率是溶劑提取的1.4～2.5倍,而色素產(chǎn)率基本一致時,利用超聲波能將提取時間縮短一半?？傊?相比于傳統(tǒng)溶劑浸提法,超聲波輔助提取能夠破壞細胞壁結(jié)構(gòu),促進色素溶出,縮短提取時間、有效提高提取率。

表2 超聲波輔助提取甜菜紅素

2.3 微波輔助提取法

在微波作用下,不同物質(zhì)吸收微波的能力存在差異,使得被萃取物質(zhì)與基體或體系分離,進入到微波吸收能力較差的萃取劑中[22]。運用微波技術(shù)提取甜菜紅素的主要研究如表3所示,此外,李昌輝等[23]對比了微波輔助提取和傳統(tǒng)溶劑提取法,采用微波法提取火龍果果皮色素提取時間由傳統(tǒng)溶劑浸提法的120 min減少到3.3 min,微波提取幾乎相當于50 ℃水浴120 min的效果。相比傳統(tǒng)溶劑提取法,微波輔助提取時間大幅度縮短,所得色素色澤鮮艷,穩(wěn)定性有所提高,且能減少溶劑消耗,提高色素提取率。

表3 微波輔助提取甜菜紅素

2.4 其他提取方法

諸多植物中含有甜菜紅素,提取方法研究十分廣泛,如超臨界CO2萃取、酶輔助提取、γ射線(Gamma irradiation)、高壓脈沖電場(Pulsed electric field),還有膜處理技術(shù)、超濾、反滲透、低直流電場和低溫冷凍等提取方法。

在超臨界狀態(tài)下,CO2超臨界流體有選擇性地把極性、沸點、分子質(zhì)量有差異的成分依次萃取出來,實現(xiàn)特定物質(zhì)的分離提取。Fathordoobady[28]用超臨界CO2萃取技術(shù)提取火龍果色素,提取效果與最優(yōu)溶劑法提取效果相當。齊明等[29]在用超臨界CO2萃取火龍果果皮粉色素時添加了極性夾帶劑,有助于色素脫離基物的束縛,而Luo等[30]優(yōu)化了超臨界CO2萃取火龍果果肉色素的條件,最佳萃取條件為30 MPa壓力、40 ℃溫度、通入CO2氣體流量為30 L/h,萃取60 min。

酶法、γ射線和高壓脈沖電場提取的主要原理是破壞植物細胞壁,促進胞內(nèi)成分流出,提高待提取生物活性成分的提取率。Mohana等[31]研究了酶濃度對火龍果渣粘度及甜菜紅素的影響。Nayak等[32]發(fā)現(xiàn)γ射線劑量在2.5～10 kGy范圍內(nèi),隨劑量增加甜菜紅素提取率逐漸增加,但γ射線劑量超過10 kGy,甜菜紅素的結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。Chalermchat等[33]利用高壓脈沖電場輔助提取紅甜菜根中甜菜紅素,高壓脈沖電場在1 kV/cm時,就可大大提高甜菜紅素的滲出率。López等[34]發(fā)現(xiàn)脈沖數(shù)為5、電壓7 kV/cm時,只需35 min可提取90%的甜菜紅素。

以超臨界萃取技術(shù)、γ射線、高壓脈沖電場以及膜處理技術(shù)為代表的最新提取技術(shù),由于可以在較低的溫度下進行,因此能夠很好的保持生物活性,并且促進了細胞裂解,改善了細胞膜的通透性,使得甜菜紅色素更容易擴散,從而提高色素的提取率。但這些技術(shù)目前都處于在研究之中,并且這些技術(shù)對設備要求較高,還未能應用于工業(yè)生產(chǎn)。

3 甜菜紅素的純化

3.1 大孔樹脂吸附法

天然色素粗提液中含有糖、果膠、脂肪、蛋白質(zhì)及無機離子等多種雜質(zhì),其溶解度、透明度、色價和穩(wěn)定性較差。目前,大孔樹脂吸附法是天然色素分離純化使用最多的方法,主要依靠和被吸附分子之間的范德華力,通過巨大的比表面進行物理吸附而達到分離提純目的[35]。

宋珊珊等[36]、陳宇等[37]先后從多種極性差異較大的大孔吸附樹脂中篩選出純化火龍果色素效果最佳的樹脂,均認為S-8型純化效果最佳。但呂思潤[38]發(fā)現(xiàn)S-8吸附率高而解析率極低,篩選出最適樹脂是X-5。不同大孔樹脂純化甜菜紅素的主要研究結(jié)果見表4。前人的研究工作主要以純化前后的色價來評判純化效果,通過大孔樹脂吸附分離可提高甜菜紅素的純度,采用柱層析法、離子交換法、膜分離法和雙水相萃取法等方法,可獲得純化更高的甜菜紅素或甜菜苷單體化合物。

表4 不同大孔樹脂純化甜菜紅素的研究比較

3.2 柱層析法

柱層析法也是常用純化甜菜紅素的方法,純化原理是物質(zhì)在固定相上的吸附能力不同,柱層析過程即是吸附、解吸、再吸附和再解吸的過程。

袁亞芳等[43]用乙醚除去色素粗提物中的脂質(zhì)、脂溶性色素、黃酮、簡單酚類等,再將色素吸附在ODSC-18固相吸附柱上,利用0.01%的鹽酸溶液洗去糖、酸等水溶性物質(zhì),用乙酸乙酯洗脫出低含量的多酚和相對低聚合度的單寧,再經(jīng)0.01%鹽酸-甲醇洗脫,將洗脫液在35 ℃下真空濃縮,去除甲醇,濃縮液以0.01%的HCl 溶液稀釋定容,得到火龍果果皮色素純化液。趙珍珍[44]也采用ODSC-18純化火龍果色素。

而王玉平[45]采用Sephadex LH-20純化甜菜紅色素以得甜菜紅素和甜菜黃素。Kujala等[46]用GPC-LH20分離純化制備出甜菜苷。柱層析法純化得到的甜菜紅素的純度較高,并可通過柱層析分離甜菜紅素混合物、獲得甜菜苷等單體化合物。

3.3 其他純化方法

甜菜紅素的純化方法還有離子交換法、膜分離法和雙水相萃取法等。Gandíaherrero等[47]采用陰離子交換層析法純化甜菜紅素,赫崇巖等[48]用超濾-納濾兩次膜分離對色素進行純化,超濾截留了大部分的蛋白質(zhì)等大分子,納濾除去了36%糖分、95%金屬離子、全部的無機鹽離子等雜質(zhì),改善了色素品質(zhì)。Chethana等[49]首次采用聚乙二醇和硫酸銨雙水相萃取甜菜紅素,萃取后的色素濃度增加了3.4倍。

Gon?alves等[50]利用凝膠滲透層析、正相柱層析、反向柱層析、反向高效液相色譜、離子交換層析和雙水相萃取技術(shù)六種方法純化甜菜苷及異甜菜苷,得出以下結(jié)論:離子交換層析法是最有效的方法,但純化后的物質(zhì)中還含有大量的鹽,顯示出最高的電導率,需要脫鹽處理;反相高效液相色譜法和反相柱層析法的純化速度較快,效果良好。

甜菜紅素較易提取獲得,同時其他組分也容易溶出,得到的提取液是含多酚、單寧、糖類、酸類、黃酮類、果膠等水溶性物質(zhì)的混合物。可以對其進一步分離純化,便于研究甜菜紅素的穩(wěn)定性和功能活性等。

3.4 甜菜紅素的穩(wěn)定性

甜菜紅素呈紫紅或鮮紅色,較不穩(wěn)定,易發(fā)生降解和變色。溫度、pH、光、氧、金屬離子和食品添加劑等均能影響其穩(wěn)定性。

甜菜紅素熱穩(wěn)定性較差,在60 ℃以上顏色逐步由紅色變成淡黃色,90 ℃時色素完全被破壞而變成無色。熱裂解后產(chǎn)生甜菜醛氨酸和環(huán)狀多巴-5-O-β葡糖苷,進一步脫羧或脫水產(chǎn)生phyllocactin、hylocerenin以及neobetanin[51],或者甜菜醛氨酸與脯氨酸結(jié)合形成indicaxanthin 和 isoindicaxanthin[52]。

甜菜紅素在pH范圍為4～7時呈紫紅色,穩(wěn)定性較好。當pH低于3時呈紫色,甜菜苷C15發(fā)生了異構(gòu)化或脫氫反應,分別生成異甜菜苷和脫氫甜菜苷;而pH大于10時色澤往黃色轉(zhuǎn)變,甜菜苷脫氫形成含酚鹽陰離子的化合物,再轉(zhuǎn)變?yōu)樘鸩它S素[6]。

光照、氧氣或氧化劑可加速色素的降解,其中紫外光照射能使色素溶液變色或褪色,純氧環(huán)境加速色素的分解,過氧化氫和次氯酸等氧化劑會降低色素的穩(wěn)定性。

Al3+、Cu2+、Zn2+和Fe3+等金屬離子會使甜菜紅素溶液紅色減褪,變成淡藍色或黃綠色;檸檬酸、酒石酸等食用酸會加速色素降解;還原劑、防腐劑會使色素穩(wěn)定性不同程度的降低;抗壞血酸對火龍果色素有一定的護色作用,但當其濃度超過0.7%,就會從色素穩(wěn)定劑轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺趸瘎53]。

因此甜菜紅素以及由該色素加工的產(chǎn)品在生產(chǎn)、運輸、存放和使用過程中應保持酸性、低溫、避光和隔氧,同時慎重選擇食品添加劑,避免使用銅鐵鋁制容器盛裝。

3.5 甜菜紅素的抗氧化活性

甜菜紅素的基本結(jié)構(gòu)中包含一個葡糖苷化的酚羥基和環(huán)胺基團,經(jīng)證實是很好的電子供體,可通過不同途徑和機制抵制對機體有氧化損傷作用的自由基,從而發(fā)揮其抗氧化作用。

表5 甜菜紅素直接清除自由基研究進展

甜菜紅素清除自由基活性與化學結(jié)構(gòu)之間有密切關(guān)系,其清除能力隨羥基或亞氨基的數(shù)量增加而增強,且鄰苯二酚是重要的活性基團[65],含有環(huán)胺基團的甜菜苷類似于抗氧化劑二丁基羥基甲苯[66]。但是糖苷配基的糖基化會降低其活性,且5-O-β-葡糖苷比6-O-β-葡糖苷的活性更低[67]。

3.5.2 抑制自由基的產(chǎn)生 體內(nèi)自由基的來源包括非酶促反應產(chǎn)生與酶促反應產(chǎn)生兩種途徑[68],甜菜紅素能夠減弱體內(nèi)過氧化物水平、抑制過渡金屬離子的氧化還原,以及抑制氧化相關(guān)酶及因子的表達,從而發(fā)揮抗氧化作用。

3.5.2.1 抑制脂質(zhì)過氧化反應 甜菜紅素可與脂質(zhì)鏈式氧化產(chǎn)生的脂自由基或脂氧自由基反應,從而終止鏈式反應,抑制脂質(zhì)氧化。Kanner等[69]研究發(fā)現(xiàn)甜菜苷抑制亞油酸過氧化反應優(yōu)于兒茶素和α-生育酚。此外,甜菜苷對H2O2激活高鐵肌紅蛋白催化低密度脂蛋白氧化反應[68]、對叔丁基過氧化氫刺激紅細胞膜脂氧化[70]及離體的低密度脂蛋白氧化[71]也具有抑制作用,可能是低密度脂蛋白與甜菜苷發(fā)生了結(jié)合作用,每毫克低密度脂蛋白可以結(jié)合0.52 nmol/L的甜菜苷[72]。

3.5.2.2 絡合金屬離子 甜菜紅素能絡合部分金屬離子,從而抑制由含未配對電子的金屬離子催化氧化產(chǎn)生自由基。Wee-Sim等[73]研究發(fā)現(xiàn)火龍果色素提取液能絡合亞鐵離子,降低游離亞鐵離子的濃度,從而降低與很多疾病有關(guān)的芬頓反應程度。Butera等[70]利用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法測得西西里刺梨中的甜菜紅素能絡合銅離子以抑制Cu2+誘導的低密度脂蛋白(LDL)的氧化。畢見州[74]發(fā)現(xiàn)半枝蓮甜菜紅素能絡合銅離子,抑制過氧化脂質(zhì)的形成,保護血管內(nèi)皮細胞,降低體內(nèi)MDA含量。

3.5.2.3 抑制氧化酶及炎癥因子的表達 甜菜紅素能夠抑制氧化酶的酶活及相關(guān)炎癥因子的表達,從而起到抗氧化作用。Vidal等[75]發(fā)現(xiàn)天然的甜菜紅素是環(huán)氧化酶和脂氧化酶的有效滅活劑,能抑制環(huán)氧化酶通過催化游離花生四烯酸形成前列腺素、抑制脂氧化酶將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為白三烯。分子對接表明甜菜紅素與酶的氨基酸發(fā)生了相互作用,并與靠近環(huán)氧化酶活性位點的Try-385和Ser-530相互作用,與靠近脂氧化酶活性位點的Lys-260相互結(jié)合,干擾酶活。Reddy等[76]發(fā)現(xiàn)100 μg/mL甜菜苷對COX-2抑制活性高達97%,抑制效果相當于180 μg/mL的阿司匹林。

內(nèi)皮細胞是抗炎分子的理想靶點,其中粘附分子的表達是一個復雜的多因素氧化還原調(diào)節(jié)過程。Gentile等[77]發(fā)現(xiàn)刺梨中提取純化微摩爾濃度的甜菜紅素和甜菜黃素可以通過其自由基清除活性調(diào)節(jié)細胞ROS/RNS水平以及兩種主要的氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1的活性,從而抑制細胞粘附分子ICAM-1的表達,保護內(nèi)皮細胞避免細胞因子誘導氧化還原狀態(tài)引起改變。Han等[78]發(fā)現(xiàn)甜菜苷對百草枯誘導的大鼠肝損傷具有保護作用,保護機制是抑制大鼠的組織學變化、降低血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平、抑制細胞P450(CYP)3A2的mRNA表達和減少線粒體損傷。Tan等[79]研究發(fā)現(xiàn)甜菜苷能降低誘導型一氧化氮合酶和環(huán)加氧酶的表達、鈍化核因子kappa B和溶酶體蛋白酶的活性,抑制百草枯誘導的氧化應激和炎癥反應,從而對百草枯誘導的急性腎損傷具有保護作用。

畢見州[74]研究得半枝蓮甜菜紅素提取物能夠顯著降低高脂血癥大鼠血清中的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),同時升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),顯著性降低血清及肝臟組織中MDA含量、提高SOD和GSH-Px活力,表明甜菜紅素提取物具有較強的體內(nèi)抗氧化效果。楊桂芹等[81]發(fā)現(xiàn)馬齒莧甜菜紅素能夠顯著降低衰老小鼠腦脂褐質(zhì)含量和心、肝、腎組織中MDA含量,提高心、肝、腎組織中SOD及GSH-Px活力,并且其抗氧化效果明顯優(yōu)于同劑量維生素E。

4 展望

甜菜紅素的提取多采用溶劑提取、超聲波和微波輔助提取法,其他新型提取技術(shù)應用較少,可進一步研究提高提取率而減少雜質(zhì)的提取方法。大孔樹脂吸附法是常用于純化甜菜紅素的方法,但純化的研究停留在工藝層面,鮮有學者分析大孔樹脂對甜菜紅素的吸附行為和機理,同時用凝膠色譜、反向高效液相色譜等方法分離甜菜紅素以獲得甜菜苷等化合物的研究較少。

雖然已有諸多學者從不同角度研究了甜菜紅素的抗氧化活性,但仍缺乏全面系統(tǒng)的探索,下一步的研究工作可從下述幾方面開展。其一,評價甜菜紅素清除自由基能力,需考慮它與不同類型自由基的反應常數(shù)及動力學。其二,甜菜紅素抑制低密度脂蛋白氧化時,可深入研究LDL的結(jié)構(gòu)和活性變化。其三,金屬離子影響甜菜紅素的穩(wěn)定性,但從反面角度考慮,甜菜紅素能絡合金屬離子,從而抑制銅、鐵離子引發(fā)的氧化反應。其四,脂氧化酶和環(huán)氧化酶等均可催化產(chǎn)生自由基,可對甜菜紅素抑制自由基酶活性相關(guān)機理進行研究。