新型銀包銅納米線的制備及在檢測羅非魚中孔雀石綠殘留中的應(yīng)用

張梓涵,趙志慧,張苑怡,樊玉霞,2,賴克強(qiáng),2,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

孔雀石綠(Malachite green,MG),又名堿性綠,是一種人工合成的三苯甲烷類工業(yè)染料,因其能抑制水生生物疾病而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]?？兹甘G在生物體中的代謝產(chǎn)物對人體有致畸、致癌、致突變的危害[2],我國已于2002年將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》,但因孔雀石綠成本低廉、藥效顯著,仍被不少養(yǎng)殖戶違法使用,導(dǎo)致水產(chǎn)品孔雀石綠安全事件層出不窮[3]。目前常用的孔雀石綠檢測方法有高效液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]。這些方法因前處理復(fù)雜、檢測時間長、對操作人員要求高,而在現(xiàn)場快速檢測中受限。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)是一種高靈敏度的分析技術(shù),通過貴重金屬納米材料的局域表面等離子體共振,使被分析粒子表面產(chǎn)生強(qiáng)電磁場增強(qiáng),實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的超靈敏檢測[7]。SERS具有檢測時間短、專一性高、靈敏度好的優(yōu)點(diǎn),近年來已被廣泛應(yīng)用牛奶中的三聚氰胺[8]、魚肉中的組胺[9]、雞尾酒中的色素添加[10]等食品中化學(xué)危害物殘留的檢測。基底的選擇是SERS技術(shù)應(yīng)用中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,目前常用的基底為金、銀及其溶膠[11-13],這些基底增強(qiáng)效果好,但價格較為昂貴。因此如何降低基底的成本,又能保證其增強(qiáng)效果已成為SERS領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

相對于單一金屬,核殼納米結(jié)構(gòu)具有更好的增強(qiáng)能力和催化活性[14],生產(chǎn)過程中減少了金、銀等貴金屬的用量,降低了成本,具有很高的實(shí)際應(yīng)用價值。雙金屬核殼納米結(jié)構(gòu)一般為較便宜的金屬外部包裹貴重金屬薄膜,制成核殼納米結(jié)構(gòu),近年來已成為研究人員的研究熱點(diǎn)。如Ye等[15]研究了銅納米線的生長過程,闡述了在其表面分別鍍上Ni、Au、Ag等多種金屬薄膜的方法,并探討了核殼結(jié)構(gòu)作為太陽能電池和有機(jī)發(fā)光二極管的應(yīng)用,結(jié)果表明,銀膜包裹的銅納米線所需后續(xù)處理最少就能達(dá)到與銀納米線相同的光電性質(zhì);Jin等[16]通過簡單的化學(xué)還原法合成了球型銀包銅納米粒子,并將其作為SERS基底對結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,該球型銀包銅納米粒子平均SERS增強(qiáng)因子約為104。目前關(guān)于銀包銅納米線作為SERS增強(qiáng)基底應(yīng)用于孔雀石綠檢測未見報道。

本研究制備了新型具有核殼結(jié)構(gòu)的銀包銅納米線,將其應(yīng)用于羅非魚中孔雀石綠殘留的檢測,通過建立PLS數(shù)學(xué)模型對檢測結(jié)果進(jìn)行定量分析,探討基底增強(qiáng)效果的穩(wěn)定性,以期獲得增強(qiáng)因子高且成本較低的新型雙金屬核殼納米SERS基底。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚魚肉 高要振業(yè)水產(chǎn)有限公司;氫氧化鈉、50%水合肼溶液、三水合硝酸銅、二甘醇、二氯甲烷、鹽酸羥胺、中性氧化鋁、對甲苯磺酸 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙腈(色譜純) 百靈威科技有限公司;L-抗壞血酸 分析純,阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司;乙二胺(EDA)、N,N-二乙基羥胺(DEHA)、35%水合肼溶液、硝酸銀、孔雀石綠(MG) Sigma-Aldrich公司。

中性氧化鋁固相萃取柱(1 g,3 mL)、丙磺酸固相萃取柱(PRS-SPE,500 mg,3 mL) Supelco公司;DXR顯微共聚焦拉曼光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;UV3000PC型紫外-可見分光光度計(UV-vis) 美譜達(dá)儀器有限公司;JEM-2100F型場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM) 日本JEOL公司;磁力攪拌器(PC-420D) 美國Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀包銅納米線(Cu-Ag NWs)的合成 通過兩步化學(xué)還原反應(yīng)制得Cu-Ag NWs[16]。

1.2.1.1 銅納米線(CuNWs)的合成 取40 mL 15 mol/L的氫氧化鈉溶液于圓底燒瓶中,依次加入2 mL硝酸銅溶液(CuNO3,0.1 mol/L)、300 μL乙二胺溶液、50 μL水合肼溶液(35% wt)。輕輕振蕩搖勻后,置于80 ℃水浴中反應(yīng)1 h,即得CuNWs。反應(yīng)得到的CuNWs用無水乙醇和1% PVP和3%水合肼的混合液洗滌數(shù)次,分散在1% PVP和3% DEHA的混合液中。4 ℃冰箱貯存待用。

1.2.1.2 銀殼的生長 取0.5 mL 1.2.2.1中制得的CuNWs分散液,加入1.2 mL的L-抗壞血酸溶液(0.1 mol/L),混勻后逐滴加入2.7 mL AgNO3溶液(1 mmol/L),持續(xù)反應(yīng)5 min后即得銀包銅納米線。將反應(yīng)液渦旋振蕩,4500 r/min離心5 min后,除去上清液,加入無水乙醇洗滌,渦旋振蕩,4500 r/min離心5 min后除去上清液,重復(fù)三次,以除去溶液中殘留的L-抗壞血酸和PVP。所得銀包銅納米線(Cu-Ag NWs)4 ℃儲存待用。

1.2.2 Cu-Ag NWs的表征

1.2.2.1 紫外光譜表掃描 分別取一定量的1.2.1中制得的CuNWs和Cu-Ag NWs于兩支潔凈試管中,加入超純水稀釋后,用紫外-可見分光光度計(UV-vis)分別測定稀釋液吸光度。光譜掃描范圍:200～800 nm。

1.2.2.2 透射電鏡掃描 用發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)對所制得的Cu-Ag NWs進(jìn)行透射電鏡掃描。最高加速電壓為200 kV,分辨率可達(dá)0.2 nm。

1.2.3 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,密封后置于-20 ℃避光保存。取一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液用50%的乙腈水溶液稀釋成0.5、1.0、3.0、5.0、20.0 ng/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,4 ℃避光保存。

1.2.4 羅非魚肉中孔雀石綠的檢測

1.2.4.1 魚肉樣品前處理 參考美國FDA標(biāo)準(zhǔn)提取羅非魚中的孔雀石綠[17]。方法如下:取一定量羅非魚肉高速均質(zhì)5 min,將均質(zhì)后的樣品充分混合。稱取5 g均質(zhì)后的魚肉樣品,依次加入pH為4.5的乙酸銨緩沖液(5 mL,0.1 mol/L)、鹽酸羥胺溶液(1 mL,0.25 g/mL)、對甲苯磺酸溶液(100 μL,1.0 mol/L),充分振蕩混合后加入25 mL乙腈,混勻后加入10 g中性氧化鋁,充分振蕩混勻后4000 r/min離心5 min。離心后將上清液轉(zhuǎn)移至裝有50 mL水和2 mL二甘醇的分液漏斗中,下層沉淀物用25 mL乙腈重復(fù)提取1次,合并上清液至分液漏斗中。

1.2.4.2 凈化 向分液漏斗中加入25 mL二氯甲烷,反復(fù)顛倒幾次混合均勻,液-液萃取分離10 min。分層后將下層溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,再向分液漏斗中加入25 mL二氯甲烷重復(fù)提取1次,將二氯甲烷層合并收集在同一圓底燒瓶中,50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干,將得到的殘渣溶解于3 mL乙腈。將用5 mL甲醇和5 mL乙腈活化過的中性氧化鋁固相萃取小柱和PRS小柱串聯(lián),加入樣液。將盛放過樣液的圓底燒瓶用乙腈反復(fù)洗滌2次,每次用5 mL乙腈。一段時間后棄去中性氧化鋁小柱,在PRS小柱加入5 mL乙腈后再加入4 mL乙酸銨和乙腈的等體積混合液洗脫,洗脫后加入乙酸銨和乙腈的等體積混合液定容至5 mL,得到羅非魚魚肉基質(zhì)液,備用。

1.2.5 SERS檢測條件 使用本實(shí)驗(yàn)室之前所用方法[18],取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品粉末1.0 g于干凈玻璃片上,進(jìn)行SERS測試,得到孔雀石綠固體SERS光譜圖;取50 μL的Cu-Ag NWs與50 μL 1.2.3所制得標(biāo)準(zhǔn)溶液(或1.2.4所得基質(zhì)液)混合均勻后,移取5 μL滴在干凈的玻璃片上,50 ℃下干燥1～2 min至玻璃片表面液體蒸干后,進(jìn)行SERS測試,分別得到孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液(圖4)和基質(zhì)液(圖5)的SERS光譜。

光譜采集條件為:633 nm激光源,20倍物鏡,激光源功率6 mW,曝光次數(shù)為10次,每次曝光時間為2 s。每個樣品在基底上隨機(jī)采集10條光譜,在不同批次的基底上重復(fù)采集3次,共獲得30條光譜,取其平均譜圖進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Delight軟件對光譜進(jìn)行平滑處理,改善譜峰重疊情況后建立偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)定量預(yù)測模型。通過模型的預(yù)測值和真實(shí)值之間的決定系數(shù)(coeffificients of determination,R2)以及樣品實(shí)際濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差之間的比值(ratio of sample standard deviation to standard error of prediction,RPD)和均方根誤差(root mean square error,RMSE)判斷模型的預(yù)測能力,R2、RPD越大,RMSE越小,說明模型預(yù)測能力越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu-Ag NWS的表征

對制得的Cu-Ag NWS進(jìn)行UV-Vis光譜掃描和透射電鏡表征,結(jié)果如圖1～圖2所示。由圖1a可知,Cu NWs的紫外吸收特征圖譜只有221 nm處有明顯的吸收峰,Cu-Ag NWs的特征峰位于265 nm處(圖1b),初步判定銅納米線上包裹上銀膜,使特征吸收峰產(chǎn)生明顯紅移,且兩條譜線半峰寬峰形均狹窄,表明膠體中粒子分散均勻。結(jié)合圖2a可知,Cu-Ag NWs呈規(guī)則的線型,且納米線長度在10 μm以內(nèi),外徑為60～70 nm;圖2b進(jìn)一步表明,Cu NWs外圍有一層均勻的銀殼,殼層厚度約為12 nm。由圖2b觀察可知,銀包銅納米線表面局部有小顆粒存在,可能為離心過程未徹底除去的溶液中聚集的銀顆粒。

圖1 紫外可見吸收圖譜

圖2 銀包銅納米線的透射電鏡圖

2.2 孔雀石綠固體拉曼圖譜分析

孔雀石綠分子結(jié)構(gòu)式及其常規(guī)拉曼光譜圖如圖3所示,譜圖中對應(yīng)的主要特征峰的歸屬情況見表1。其中436 cm-1處特征峰由平面外苯基-C-苯基振動引起;796 cm-1處特征峰由平面外環(huán)上C-H振動引起;1174 cm-1處特征峰由面內(nèi)環(huán)上C-H彎曲振動引起;1364、1615 cm-1處特征峰則分別對應(yīng)N-苯基伸縮振動、環(huán)上C-C伸縮振動[19]。

圖3 孔雀石綠分子式及固體拉曼圖譜

表1 孔雀石綠常規(guī)拉曼峰歸屬

2.3 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS檢測

不同濃度的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS圖譜如4所示。由圖4可知,不同濃度的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS譜圖與其常規(guī)固體拉曼譜圖總體上是一致的,特征峰發(fā)生一定程度的紅移,其中1174、1364、1615 cm-1處的特征峰分別紅移至1176、1371、1618 cm-1處。使用此銀包銅納米線作為基底沒有對孔雀石綠的特征信號造成影響,未出現(xiàn)雜峰或特征峰的較大偏移,這可能與孔雀石綠分子吸附在Cu-Ag NWs基底上的位置或方向存在差異及分子振動類型不同有關(guān)[20]。因此,此銀包銅基底可用于溶液體系中孔雀石綠的測定。

圖4 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS圖譜

由圖4可知,特征峰強(qiáng)度隨孔雀石綠濃度從0增加到20 μg/kg而呈規(guī)律性的增強(qiáng)。當(dāng)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度低至0.5 μg/kg時,其主要拉曼特征峰依然清晰可辨。利用二階導(dǎo)數(shù)變換可以分離重疊峰,消除基線漂移,提高光譜分辨率,如圖5二階導(dǎo)數(shù)圖譜(及1550～1600 cm-1局部放大圖)所示,經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)變換,可清晰觀察到濃度為0和0.5 μg/kg的孔雀石綠拉曼圖譜。由SERS圖譜及二階導(dǎo)數(shù)圖譜可知,特征峰強(qiáng)度隨孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度增大而增強(qiáng),峰強(qiáng)度與濃度之間可能存在著較好的線性關(guān)系。為此采用偏最小二乘法建立模型,確立實(shí)際濃度和預(yù)測濃度之間的關(guān)系。如圖6所示,PLS模型結(jié)果為:R2=0.967、RPD=5.897、RMSE=1.077,顯示實(shí)際濃度與預(yù)測濃度具有良好的線性相關(guān)性,這種良好的線性關(guān)系可以歸結(jié)為SERS基底上增強(qiáng)熱點(diǎn)的均勻分布,若增強(qiáng)熱點(diǎn)在基底上分布不均勻,可能導(dǎo)致目標(biāo)分析物拉曼信號發(fā)生較大變化,從而使被分析物難以量化[20]。

圖5 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液二階導(dǎo)數(shù)圖譜

圖6 PLS模型

2.4 羅非魚肉中孔雀石綠殘留檢測

魚肉是一種復(fù)雜的食品基質(zhì),其中的蛋白質(zhì)、脂肪、色素等化學(xué)成分可能對目標(biāo)化合物的分析檢測造成一定的影響或干擾[21],利用Cu-Ag NWs作為SERS基底進(jìn)一步對羅非魚中孔雀石綠提取液進(jìn)行檢測。如圖7所示,可見魚肉樣品經(jīng)過前處理后已較為純凈,但仍有少量雜質(zhì)殘存對其SERS檢測產(chǎn)生了影響,所得譜圖與孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS圖譜相比相差不大,特征峰在1177 cm-1處發(fā)生了輕微紅移,1373和1619 cm-1處發(fā)生了輕微紅移。與孔雀石綠固體拉曼圖譜相比,魚肉中孔雀石綠提取液的SERS圖譜主要特征峰強(qiáng)度變化較小,但整體發(fā)生了明顯的紅移,其中幾處譜峰紅移明顯。具體譜峰變化如下:孔雀石綠固體拉曼圖譜中1174 cm-1紅移至1177 cm-1;1364 cm-1處紅移至1373cm-1;1615 cm-1處紅移至1619 cm-1。

圖7 羅非魚中孔雀石綠SERS圖譜

由圖8觀察到特征峰強(qiáng)度與孔雀石綠濃度間呈良好的相關(guān)性,圖8為796,436,1177,1619 cm-1處特征峰強(qiáng)度與1～10 μg/kg濃度的對應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明,孔雀石綠濃度與特征峰強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,回歸直線方程分別為y=443.85x+447.83,y=620.19x+732.22,y=838.23x+775.96,y=1083.8x+1087.1(x為孔雀石綠濃度,y為特征峰強(qiáng)度);R2分別為0.9738,0.9467,0.9751,0.9692。進(jìn)一步結(jié)合化學(xué)計量法建立PLS模型對魚肉樣品中的孔雀石綠殘留進(jìn)行定量分析,如圖9所示,PLS模型顯示了較好的預(yù)測能力,其R2為0.95,RPD為6.171,RMSE為0.595。表明此方法對于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的定量分析與檢測具有巨大潛力。

圖8 拉曼位移為436,796,1177,1619 cm-1處的特征峰強(qiáng)度與孔雀石綠濃度的關(guān)系圖

圖9 PLS模型

為探究此方法檢測孔雀石綠的最低檢測濃度,在孔雀石綠濃度為0～1.0 μg/kg范圍內(nèi)設(shè)置濃度梯度。圖10A為孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0、0.3、0.5 μg/kg時的SERS圖譜,可見當(dāng)孔雀石綠濃度為0.5 μg/kg時,特征峰已清晰可見;圖10B為魚肉基質(zhì)液中孔雀石綠濃度分別為0.5、0.7、1.0 μg/kg時的SERS圖譜,由圖可知,當(dāng)孔雀石綠濃度為0.7 μg/kg時,可觀察到1177、1373、1619 cm-1處的特征峰,當(dāng)濃度升高至1.0 μg/kg時,特征峰清晰可見。魚肉基質(zhì)中含有的復(fù)雜組分對SERS檢測結(jié)果產(chǎn)生影響,導(dǎo)致魚肉基質(zhì)液中孔雀石綠最低可檢測濃度(1.0 μg/kg)高于孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液最低檢測濃度(0.5 μg/kg)。

圖10 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液及魚肉基質(zhì)液中孔雀石綠SERS圖譜

3 結(jié)論

以乙二胺還原法制備的銅納米線為種子,再利用L-抗壞血酸還原法在銅納米線表面鍍上一層銀殼,成功制備出Cu-Ag NWs,將其應(yīng)用于羅非魚中孔雀石綠殘留的檢測。結(jié)果表明,PLS模型中R2均大于0.95,RPD接近于6,模型顯示很好的預(yù)測能力。羅非魚基質(zhì)液中孔雀石綠濃度與特征峰強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,回歸直線方程的R2分別為0.9738,0.9467,0.9751,0.9692?；讓兹甘G標(biāo)準(zhǔn)溶液和羅非魚中孔雀石綠提取液的最低檢出濃度分別為0.5、1.0 μg/kg,我國針對水產(chǎn)品中孔雀石綠的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 19857-2005)采用高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,檢出限分別為2.0 μg/kg、0.5 μg/kg,該方法的檢出限基本滿足檢測要求,但此方法操作步驟簡化、檢測時間大大縮短,更容易滿足實(shí)際樣品的快速檢測需求。