蘿種子生物堿提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性

孔 越,郭 斌,*,韓冠英,崔 鏨

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000)

蘿藦(Metaplexisjaponica)為蘿藦科蘿藦屬植物,多年生草質(zhì)纏繞藤本,種子卵圓形,頂端有白色長絹毛,主要生長在我國東北、華北、華東等地。蘿藦中含有甾類、生物堿類、萜類、黃酮類、糖類和蛋白質(zhì)等多種有效成份[1]。近年來,蘿藦由于其生物活性作用而備受關(guān)注,其揮發(fā)油和脂肪油均具有抗菌、抗氧化、抗炎等作用,具有較高藥用價(jià)值[2-4]。劉威等[5]將新鮮蘿藦小分子提取物應(yīng)用于荷肝癌H22小鼠體內(nèi)抗癌實(shí)驗(yàn),確定鮮蘿藦小分子提取物有明顯抗肝癌H22的作用。楊蕾[6]通過定性實(shí)驗(yàn),確定蘿藦藤中有生物堿類化合物。

提取生物堿的常見方法有微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助法、有機(jī)溶劑提取法等[7]。微波輔助提取法雖然提取效率高、溶劑使用量少[8],但是該技術(shù)只適用于熱穩(wěn)定的物質(zhì)[9]。超臨界萃取法萃取效率高,但對(duì)大分子和極性基團(tuán)多的物質(zhì)溶解性差,需加入夾帶劑,增加了能耗和污染,費(fèi)力費(fèi)時(shí)[10]。溶劑法成本低,操作簡單,根據(jù)生物堿的性質(zhì)。溶劑法提取用的溶劑通常采用水、酸水-有機(jī)溶劑(常用0.5～1.0%的鹽酸、乙酸等為溶劑)、醇或堿化有機(jī)溶劑4種不同的溶劑[11]。目前已有很多種植物的生物堿提取工藝研究報(bào)道[12],但是卻未見對(duì)蘿藦種子生物堿提取工藝的報(bào)道。

本文采用酸水提取法,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化蘿藦種子總生物堿提取工藝,并通過抑菌實(shí)驗(yàn)初步研究蘿藦種子總生物堿對(duì)三種供試菌種的抑菌活性,為開發(fā)和利用蘿藦種子資源提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘿藦種子 采自于遼寧省錦州市周邊地區(qū),經(jīng)錦州市藥品檢驗(yàn)所翟鐵紅主任藥師鑒定為蘿藦屬蘿藦種子;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 錦州醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供;LB培養(yǎng)基 酵母提取物5 g,蛋白胨10 g、NaCl 10 g,加水至1000 mL,固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂粉;氫氧化鈉、石油醚(沸點(diǎn)規(guī)格30～80 ℃)、二氯甲烷 天津永晟精細(xì)化工有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

HH-4型電熱恒溫水浴鍋 上海騰方儀器有限公司;BP211D型電子分析天平 德國Sartorious公司;PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DHG-9245A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LDZM立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HR60-II-A2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘿藦種子生物堿的提取方法 將蘿藦種子研磨成粉末,取粉碎后的粉末放入石油醚中浸泡過夜[13],蘿藦種子粉末:石油醚為1∶2 g/mL,抽濾,晾干,裝于密封袋放置干燥處以備用。

取脫脂后蘿藦種子粉末加入錐形瓶中,按一定比例加入濃度為0.1 mol/L的一定pH鹽酸水溶液,放入水浴鍋中,在一定溫度和時(shí)間的條件下進(jìn)行提取,抽濾,收集濾液,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,在濃縮液中加入適量的堿性水溶液調(diào)節(jié)pH至10～11,濃縮液出現(xiàn)渾濁沉淀,將濃縮液干燥即得蘿藦種子總生物堿。

1.2.2 蘿藦種子總生物堿得率的測(cè)定 用重量法[14]計(jì)算總生物堿得率。

1.2.3 蘿藦種子總生物堿的單因素實(shí)驗(yàn) 以蘿藦種子總生物堿得率為指標(biāo),分別考察鹽酸水溶液pH、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響,每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)水平,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,取平均值。

1.2.3.1 鹽酸水溶液pH對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個(gè)錐形瓶中,采用1.2.1中提到的方法,在料液比1∶10 g/mL、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間1.0 h的條件下,考察鹽酸水溶液pH(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0)對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.3.2 料液比對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個(gè)錐形瓶中,在鹽酸水溶液pH為2、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間1.0 h的條件下,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個(gè)錐形瓶中,在鹽酸水溶液pH為2、料液比1∶20 g/mL、提取時(shí)間1.0 h的條件下,考察提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 準(zhǔn)確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個(gè)錐形瓶中,在提取液pH為2、料液比1∶20 g/mL、提取溫度80 ℃的條件下,考慮提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.4 蘿藦種子總生物堿的正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇鹽酸水溶液pH、料液比、提取溫度和提取時(shí)間四個(gè)影響因素,每個(gè)因素選取三個(gè)水平作正交試驗(yàn),以蘿藦種子總生物堿得率為衡量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的指標(biāo),對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以確定更好的提取工藝條件。各因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

1.2.5 蘿藦種子總生物堿抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 蘿藦種子總生物堿的提取 取脫脂后的蘿藦種子粉末10 g,加入pH為2的鹽酸水溶液200 mL,放入水浴鍋中,在70 ℃下提取2.0 h,用無菌水將得到的蘿藦種子總生物堿稀釋成濃度分別是0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的蘿藦種子總生物堿溶液。

1.2.5.2 菌懸液的制備 將三種供試菌種在無菌操作臺(tái)分別接種于無菌平板上,在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,用接種環(huán)挑取典型菌落轉(zhuǎn)移接種在LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,用無菌生理鹽水將其稀釋成含菌量為1×106～1×107CFU/mL的菌懸液,備用。

1.2.5.3 蘿藦種子總生物堿抑菌作用 采用牛津杯法[15]測(cè)定蘿藦種子總生物堿的抑菌作用。在生物安全柜上將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入20 mL左右培養(yǎng)基,待冷卻凝固后,用移液槍吸取0.1 mL菌懸液加到培養(yǎng)基平板上,然后用無菌L型玻璃棒涂布均勻。用無菌鑷子夾取已干燥滅菌的牛津杯(內(nèi)徑為6.00 mm)垂直放在含菌平板上,在每個(gè)牛津杯中分別加入200 μL(濃度為0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL)的總生物堿溶液,用無菌生理鹽水做對(duì)照。最后將培養(yǎng)皿放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5.4 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用兩倍稀釋法[16],將在最優(yōu)條件下制備的總生物堿用無菌水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL濃度的稀釋液,將稀釋液分別移取2 mL至無菌培養(yǎng)皿中,然后分別將20 mL固體培養(yǎng)基倒入其中充分混勻,待其凝固后,在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入0.1 mL菌懸液,涂布均勻,放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)菌生長情況。以不加稀釋液的培養(yǎng)皿為空白對(duì)照,以無細(xì)菌生長的培養(yǎng)基中最低稀釋液濃度為最低抑菌濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 鹽酸水溶液pH對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖1可知,總生物堿隨著pH的增加(pH1.0～5.0),生物堿得率呈先增高后降低的趨勢(shì),在pH為3的條件下,生物堿得率最高;當(dāng)pH大于3時(shí),生物堿得率隨pH的不斷增高反而下降。考慮到可能由于蘿藦種子中生物堿含有與酸發(fā)生反應(yīng)的成分[17]。因此提取蘿藦種子總生物堿時(shí),鹽酸水溶液pH為2.0、3.0、4.0作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖1 鹽酸水溶液pH對(duì)生物堿得率的影響

2.2.2 料液比對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖2可以看出,蘿藦種子總生物堿得率隨著料液比的增加呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì),在料液比1∶20 g/mL時(shí)總生物堿得率達(dá)到最大值;在料液比高于1∶20 g/mL時(shí),總生物堿得率隨著料液比增大而降低。這可能是由于在一定范圍內(nèi)增加料液比有助于增大提取溶劑與浸提物的接觸面積,提高提取效率[18],但是用量過大反而不利于蘿藦種子總生物堿的溶出,降低提取效率。故選定料液比1∶20 g/mL左右。

圖2 料液比對(duì)生物堿得率的影響

2.2.3 提取溫度對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖3可以看出,當(dāng)溫度小于80 ℃時(shí),隨著溫度的升高蘿藦種子總生物堿得率逐漸提高;當(dāng)溫度為80 ℃時(shí),總生物堿得率最高。這是由于溫度在80 ℃時(shí)能更好的破解細(xì)胞壁,使生物堿更容易提取出來,從而使總生物堿得率達(dá)到最佳。然而當(dāng)溫度大于80 ℃時(shí),蘿藦種子總生物堿得率反而開始下降;這是因?yàn)闇囟冗^高,會(huì)破壞其中活性成分,增加溶質(zhì)雜出量,為后續(xù)操作帶來不便[19]。因此,選擇提取溫度80 ℃左右最為合適。

圖3 提取溫度對(duì)生物堿得率的影響

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖4可以看出,在0.5～2.0 h的范圍內(nèi),蘿藦種子總生物堿得率隨著時(shí)間增加而逐漸升高,但是時(shí)間超過2.0 h后,總生物堿得率明顯下降。這可能是由于提取時(shí)間過長,影響一部分生物堿的結(jié)構(gòu),而且隨著時(shí)間的增加,提取溶劑的揮發(fā)也進(jìn)一步影響著提取率[20]。當(dāng)提取時(shí)間為2.0 h時(shí),蘿藦種子總生物堿得率最高。因此,選擇2.0 h左右為提取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)生物堿得率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

由表2可知,極差的大小反映了實(shí)驗(yàn)因素對(duì)考察指標(biāo)的影響程度,極差越大,實(shí)驗(yàn)因素對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響就越大。因此,在四個(gè)影響蘿藦種子總生物堿提取工藝的因素中,對(duì)總生物堿得率的影響作用大小是:鹽酸水溶液pH>提取溫度>提取時(shí)間>料液比。蘿藦種子總生物堿的最佳提取工藝是A1B2C2D1,即鹽酸水溶液pH為2、料液比1∶20 g/mL、提取時(shí)間2.0 h、提取溫度70 ℃。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知,鹽酸水溶液pH、提取溫度對(duì)蘿藦種子總生物堿得率有顯著影響,提取時(shí)間和料液比對(duì)蘿藦種子總生物堿得率的影響不顯著。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察以上優(yōu)化工藝的可行性,取蘿藦種子粗粉三份,每份各10 g,按照優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行提取:鹽酸水溶液pH為2.0、料液比1∶20 g/mL、提取時(shí)間2.0 h、提取溫度70 ℃。按1.2.1的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn),得出總生物堿平均得率為2.91%,該結(jié)果高于正交實(shí)驗(yàn)其他組合,表明該提取條件穩(wěn)定可行。

2.5 蘿藦種子總生物堿抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 蘿藦種子總生物堿的抑菌效果 蘿藦種子總生物堿對(duì)三種供試菌種的抑菌效果見表4。由表4可以看出蘿藦種子總生物堿除了對(duì)大腸桿菌沒有抑菌效果外,對(duì)其他兩種菌均有不同程度的抑菌效果。其中,蘿藦種子總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng),其次是枯草芽孢桿菌。不同濃度的提取物對(duì)供試菌種的抑菌效果也不同,隨著濃度的增高,其抑菌效果也逐漸增強(qiáng)。由此得出,蘿藦種子總生物堿具有一定的抑菌活性。

表4 不同濃度的蘿藦種子總生物堿抑菌效果

2.5.2 蘿藦種子總生物堿最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 如表5所示,蘿藦種子總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.2 mg/mL,對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.4 mg/mL。蘿藦種子總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最大,對(duì)枯草芽孢桿菌次之,對(duì)大腸桿菌沒有抑菌活性,抑菌活性隨著生物堿濃度的增大而加強(qiáng)。

表5 蘿藦種子總生物堿對(duì)供試菌種的最低抑菌濃度(MIC)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)蘿藦種子總生物堿的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定蘿藦種子總生物堿的最佳提取工藝是:鹽酸水溶液pH為2、料液比1∶20 g/mL,提取時(shí)間2.0 h,提取溫度70 ℃,在此工藝下蘿藦種子總生物堿得率為2.91%。抑菌實(shí)驗(yàn)表明,蘿藦種子總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌效果,MIC分別為0.2、0.4 mg/mL,尤其對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng),對(duì)大腸桿菌沒有抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)為開發(fā)和利用蘿藦種子資源提供一定的理論依據(jù),也有助于進(jìn)一步研究蘿藦種子生物堿的價(jià)值。