虎杖白藜蘆醇、槲皮素異構(gòu)體聯(lián)用抗生素對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的抑制作用

陳尚岳,紀(jì)亞明,李玉環(huán),于海霞,謝敬亮,舒揮文,孫穎玲,張妙良,薛喜才,何 羽

(北京小湯山醫(yī)院,北京 102211)

耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)是臨床上最常見的病原菌之一,自1961年被發(fā)現(xiàn)以來,其耐藥比例逐年上升[1]。由于廣譜抗生素的普遍使用,MRSA目前對(duì)苯唑西林、紅霉素、頭孢曲松、頭孢唑林以及β內(nèi)酞胺類均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性,已成為目前現(xiàn)有抗生素難以控制的致病菌之一[2-3],給醫(yī)護(hù)工作人員造成了極大的困難。因此,尋找新的抑菌策略或藥物對(duì)MRSA進(jìn)行有效的防治成為目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

MRSA的敏感抗生素主要有萬古霉素、替考拉寧、去甲萬古霉素等,且國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)耐藥例子;但以上抗生素存在價(jià)格昂貴、腎毒性大等缺點(diǎn),臨床用藥時(shí)需謹(jǐn)慎選擇[4]。為了克服以上難題,近年來采用聯(lián)合用藥方式對(duì)MRSA進(jìn)行防治取得了良好的效果,如克拉維酸與阿莫西林或替卡西林聯(lián)用可有效增強(qiáng)抗生素的抑菌效果[5],萬古霉素聯(lián)用苯唑西林對(duì)MRSA的殺菌效果可達(dá)90%以上等[6],已成為目前MRSA防治的重要手段。然而,多數(shù)藥物為抗生素間的聯(lián)用,無形間增加了出現(xiàn)新型耐藥菌株的風(fēng)險(xiǎn),因此,尋找某種既可增強(qiáng)抗生素抑菌作用,又能降低細(xì)菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)的藥物是目前需要迫切解決的問題。

有報(bào)道指出,多酚類化合物中的白藜蘆醇和槲皮素異構(gòu)體等,可有效地阻礙細(xì)菌的外排機(jī)制,增強(qiáng)抗生素的抑菌效果[7],且該類化合物通常還具有抗炎,抗過敏,抗真菌,抗微生物和抗氧化等多種藥理學(xué)性質(zhì)[8-10]。為了評(píng)估白藜蘆醇、槲皮素異構(gòu)體與抗生素聯(lián)用是否具有增強(qiáng)抗生素的抑菌作用,本文選用虎杖白藜蘆醇、槲皮素異構(gòu)體與不同抑菌機(jī)理的抗生素進(jìn)行聯(lián)合用藥,通過微量稀釋法和K-B擴(kuò)散法探究聯(lián)合用藥的抑菌效果,為多酚類化合物與抗生素的聯(lián)合用藥研究提供進(jìn)一步的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

測(cè)試細(xì)菌MRSA(MJMC001型) 由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院提供;小鼠肺成纖維細(xì)胞系的L929細(xì)胞株 上海素爾生物科技有限公司;環(huán)丙沙星(CIP)、苯唑西林(OXA)、紅霉素(ERY)為抗生素類,槲皮素異構(gòu)體(MOR)、虎杖白藜蘆醇(RES)為黃酮類藥物,二甲基亞砜(DMSO,100%) 購自美國(guó)sigma公司;肉湯培養(yǎng)基(Mueller-Hinton) 上海西寶生物科技股份有限公司;尼龍網(wǎng) 南京建成生物科技有限公司。

高壓蒸汽滅菌鍋(GI54D型) 廈門致微儀器;紫外分光光度計(jì)(TU-1901)北京普析;酶標(biāo)儀(BS～1101型) 美國(guó)Bio-Tek;恒溫?fù)u床(HZ250LBG型) 武漢瑞華儀器;Accuri C6流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的配制 將適量MRSA菌株接入肉湯培養(yǎng)基(MH)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),接種量1%,于150 r/min,37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)4 h,當(dāng)OD600為0.4時(shí)(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期),取出菌液稀釋至終濃度為1.0×107CFU/mL備用。

1.2.2 藥液的配制 采用10%(v∶v)的二甲基亞砜(DMSO)溶解藥品,并統(tǒng)一稀釋至5000 mg/L備用。

1.2.3 單藥的最低抑菌濃度測(cè)定 最低抑菌濃度(MIC)即抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物使用濃度,CIP、OXA、ERY、MOR、和RES單用的MIC采用微量稀釋法測(cè)定[11]。在96孔板中,每孔加入180 μL 新鮮MH培養(yǎng)液,后加入10 μL藥液(終濃度為抗生素:50～500 mg/L;多酚類化合物1000～5000 mg/L)和10 μL菌液(約105CFU/mL),空白孔中加入190 μL新鮮MH培養(yǎng)液和10 μL藥液,每組設(shè)置三個(gè)平行,樣品添加完成后,37 ℃下培養(yǎng)24 h,檢測(cè)OD600值(或觀察無菌生長(zhǎng))確定各藥物單用時(shí)的MIC。

1.2.4 聯(lián)合用藥的抑菌試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)通過微量稀釋法和K-B擴(kuò)散法測(cè)定RES、MOR與抗生素聯(lián)用的抑菌效果,并與單藥的抑菌效果進(jìn)行比較?？紤]到兩種不同化合物之間可能存在相互作用而最終出現(xiàn)對(duì)MRSA不同的抑制作用[12],本實(shí)驗(yàn)將聯(lián)合用藥的抑菌作用分為協(xié)同、促進(jìn)、無關(guān)和拮抗作用。以抑菌指數(shù)(FIC)作為判斷依據(jù),若FIC≤ 0. 5,則為協(xié)同作用,當(dāng)0. 5

1.2.4.1 微量稀釋法 根據(jù)Bonapace等[11]的測(cè)定方法,在酶標(biāo)版上,每孔加入180 μL新鮮培養(yǎng)液,5 μL抗生素藥液(使終濃度為1/8 ～ 2 MIC),5 μL的RES、MOR(使終濃度為1/4 ～ 2 MIC)和10 μL菌液(約105CFU/mL),另以20 μL DMSO作為空白對(duì)照。37 ℃下培養(yǎng)24 h,檢測(cè)OD600值(或無菌生長(zhǎng))確定聯(lián)合用藥的MIC(抗生素/RES、MOR)。

1.2.4.2 K-B法 參考Pfaller等[14]的優(yōu)化方法,根據(jù)微量稀釋法所得藥物聯(lián)用的MIC,在含有RES或MOR的MH瓊脂平板(90 mm)中,將MRSA菌液均勻地涂抹于平板上,隨后接入無菌紙片,向紙片中加入10 μL抗生素(聯(lián)用MIC),另以不加RES或MOR的MH平板作為空白組,37 ℃下培養(yǎng)24 h后,記錄抑制圈直徑(IZD)大小。

1.2.5 聯(lián)合用藥的殺菌實(shí)驗(yàn) 參考Bonapace等[11]的實(shí)驗(yàn)方法,在10 mL新鮮MH培養(yǎng)基中,加入組合藥(OXA+RES、OXA+MOR、CIP+RES、CIP+MOR)液100 μL(終濃度為聯(lián)用MIC),隨后接入100 μL菌液(終濃度約為105CFU/mL),另以不加任何藥物的MH培養(yǎng)液作為空白對(duì)照,以抗生素單用(MIC)作為陰性對(duì)照(OXA、CIP),于37 ℃,150 r/min下恒溫?fù)u床培養(yǎng),分別在0、4、8、12、16和24 h取樣100 μL,以無菌水稀釋至1 mL后,經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),并繪制聯(lián)合用藥對(duì)MRSA的殺菌曲線。

1.2.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)以小鼠肺成纖維細(xì)胞系的L929細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用MTS法評(píng)估有效抑菌藥物組合的細(xì)胞毒性[15]。首先將細(xì)胞株接種于高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),繼續(xù)孵育5～7 d后以0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,并將細(xì)胞懸液濃度統(tǒng)一稀釋至1.0×106CFU/mL備用。

在96孔酶標(biāo)板上每孔接入100 μL細(xì)胞懸液(約105CFU/mL),并于5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后加藥處理(OXA、OXA+MOR、OXA+RES、CIP、CIP+MOR、CIP+RES),對(duì)照組不加任何藥物。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTS溶液20μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h,于490 nm下測(cè)定其吸光值(OD值)[16,17],計(jì)算細(xì)胞存活率[18]。

細(xì)胞存活率(%)=(加藥OD值-對(duì)照OD值)×100/對(duì)照OD值

1.3 數(shù)據(jù)處理

聯(lián)合用藥的抑菌效果采用Oringin 9.0進(jìn)行擬合分析,殺菌曲線的活菌計(jì)數(shù)采用Accuri C6軟件(流式細(xì)胞儀自帶軟件)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單藥MIC結(jié)果

藥物單用時(shí)的MIC如圖1所示,RES和MOR的MIC分別為4500和3000 mg/L,ERY、OXA和CIP的MIC分別為250、200、100 mg/L。根據(jù)張芳等[19]和Nakaune等[20]的研究結(jié)果,RES可干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成,抑制細(xì)菌代謝的磷酸化水平、NF-xB核轉(zhuǎn)移和N-FB的相關(guān)信號(hào)通路,并影響細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,從而達(dá)到抑菌效果。MOR的抑菌機(jī)理目前還不清楚,但關(guān)于槲皮素及其衍生物的抑菌作用,已有相關(guān)報(bào)道[21-23],且郭艷華等[24]的研究發(fā)現(xiàn),通過化學(xué)改性后的槲皮素,不僅克服了其水溶性差等缺點(diǎn),還增強(qiáng)了其抑菌作用。ERY可與敏感細(xì)菌50S核蛋白體亞基可逆性結(jié)合,通過抑制核蛋白體受體部位的正常結(jié)合,阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而達(dá)到抑菌效果[25]。OXA屬于青霉素類抗生素,主要通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而發(fā)揮殺菌作用[26]。而CIP作為一種喹諾酮類藥物,是DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑,可作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶,干擾DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋過程,從而阻礙DNA的復(fù)制,起到了慢效殺菌的作用[27]。

圖1 單藥的MIC值

2.2 聯(lián)合用藥的抑菌效果

聯(lián)合用藥的抑菌效果如表1所示。通過K-B法測(cè)得藥物單用(MIC)IZD的大小順序?yàn)镃IP>ERY>OXA>MOR>RES,由微量稀釋法測(cè)得ERY聯(lián)用RES、MOR的FIC分別為2和1.5,這表明ERY聯(lián)用RES或MOR不能增強(qiáng)ERY對(duì)MRSA的抑菌作用,且ERY聯(lián)用RES的IZD(12.1 mm)與單藥IZD(15.3 mm)相比縮小了26.4%,表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。這可能是由于ERY與RES發(fā)生了某種相互作用,使得有效藥物濃度降低,從而導(dǎo)致ERY對(duì)MRSA的抑制作用減弱[28]。然而OXA、CIP與RES、MOR的聯(lián)合用藥均可不同程度地增強(qiáng)抗生素對(duì)MRSA的抑制作用,抑菌指數(shù)為0.5≤ FIC ≤1.0,抗生素的使用量減少了50%～75%,其中CIP聯(lián)用MOR的抑菌效果最優(yōu),抑菌指數(shù)為0.5,CIP用量減少75%,表現(xiàn)為藥物協(xié)同作用。這表明RES、MOR均可作為OXA或CIP的增強(qiáng)劑,對(duì)抗生素的抑菌作用具有顯著的促進(jìn)效應(yīng)(p<0.05)。然而不同的是,三種抗生素聯(lián)用RES或MOR的IZD值呈現(xiàn)出高度一致的縮小趨勢(shì),根據(jù)魯曉翔[29]的研究發(fā)現(xiàn),雖然多酚類化合物具有廣泛的抑菌活性,但卻不具備專一性,其對(duì)MRSA可能是非定向作用,因此最終導(dǎo)致IZD出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象。

表1 藥物聯(lián)用對(duì)MRSA的抑制效果

2.3 聯(lián)合用藥的殺菌曲線

OXA聯(lián)用RES、MOR的殺菌曲線如圖2所示。當(dāng)OXA(1/2 MIC)與RES(1/4 MIC)或MOR(1/2 MIC)聯(lián)用時(shí),殺菌作用極顯著增強(qiáng)(p<0.01)。在時(shí)間為24 h時(shí),OXA單用、OXA聯(lián)用RES、OXA聯(lián)用MOR的活菌數(shù)仍呈現(xiàn)出遞減趨勢(shì),因此,OXA聯(lián)合用藥的殺菌強(qiáng)弱順序?yàn)?OXA+MOR>OXA+RES>OXA。一般認(rèn)為,OXA作為一種青霉素類抗生素,主要是抑制MRSA細(xì)胞壁合成[19],而RES除可干擾細(xì)胞壁合成外,還可影響細(xì)菌IxBa磷酸化水平,逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥機(jī)制,因此與OXA聯(lián)用起到增強(qiáng)殺菌作用的效果。關(guān)于MOR的抑菌機(jī)理目前尚不清楚。Yoshizumi等[30]的研究發(fā)現(xiàn),槲皮素衍生物可抑制細(xì)胞磷脂酰肌醇3-激酶介導(dǎo)的c-Jun N-末端激酶的活性,有利于心血管疾病的治療。但關(guān)于MOR是否具有同樣的抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

圖2 苯唑西林聯(lián)用白藜蘆醇或槲皮素異構(gòu)體的殺菌曲線

CIP聯(lián)用RES、MOR的殺菌曲線如圖3所示,CIP作為一種慢效殺菌的喹諾酮類抗生素,RES或MOR聯(lián)用時(shí),其殺菌效果顯著增強(qiáng),活菌數(shù)量下降明顯。在24 h時(shí),CIP單用(MIC)、CIP聯(lián)用RES、CIP聯(lián)用MOR條件下的活菌數(shù)亦呈現(xiàn)遞減趨勢(shì),其殺菌強(qiáng)弱順序?yàn)?CIP+MOR>CIP+RES>CIP。由于RES可抑制細(xì)胞壁的合成,影響細(xì)胞膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和通透性[31],因此RES與CIP聯(lián)用時(shí),CIP作用于MRSA胞內(nèi)的藥物濃度加大,因此對(duì)MRSA胞內(nèi)DNA活動(dòng)的抑制作用增強(qiáng),從而導(dǎo)致殺菌效果的顯著提升,這與宋曉言等[32]研究30 味中藥提取物與CIP聯(lián)用對(duì)豬源鏈球菌的體外抑菌結(jié)果相類似。然而,關(guān)于MOR對(duì)CIP的增強(qiáng)效應(yīng)及其抑菌機(jī)理還有待深入研究。

圖3 環(huán)丙沙星聯(lián)用白藜蘆醇、槲皮素異構(gòu)體的殺菌曲線

2.4 細(xì)胞毒性研究結(jié)果

有效抑菌藥物組合的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。OXA或CIP單用時(shí),小鼠細(xì)胞的存活率分別為93.8%和94.5%,這表明兩種抗生素對(duì)小鼠細(xì)胞均具有輕微細(xì)胞毒性,然而OXA聯(lián)用RES和CIP聯(lián)用RES的細(xì)胞存活率分別為95.3%和96.1%,因此,RES與兩種抗生素的聯(lián)合用藥均不會(huì)增加對(duì)小鼠纖維細(xì)胞的毒性作用,且細(xì)胞存活率有所上升。這可能與RES本身所具有的抗氧化、清除氧自由基等藥理學(xué)特性有關(guān)[33]。而當(dāng)MOR與OXA或CIP聯(lián)用時(shí),細(xì)胞存活率與抗生素單用相比分別降低了8.9%和7.2%,這表明MOR與兩種抗生素的聯(lián)用呈現(xiàn)出微弱細(xì)胞毒性增加的現(xiàn)象。根據(jù)Hou等[34]的研究發(fā)現(xiàn),MOR在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)與槲皮素相比具有較大差異,藥物殘留濃度較高,因此對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用。然而,Ferry等[35]研究認(rèn)為,MOR對(duì)人體細(xì)胞的毒性有限,與抗生素藥物聯(lián)用時(shí)不會(huì)引起細(xì)胞的損傷或凋亡。因此,關(guān)于MOR的細(xì)胞毒性機(jī)理還需要進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 有效抑菌藥物組合的細(xì)胞毒性

3 結(jié)論

本文旨在探究聯(lián)合用藥對(duì)MRSA的抑制作用,并尋找新的抑菌藥物組合或抗生素增強(qiáng)劑。通過微量稀釋法發(fā)現(xiàn)虎杖白藜蘆醇和槲皮素異構(gòu)體對(duì)MRSA均具有天然抑菌活性,其MIC分別為4500和3000 mg/L。藥物聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅霉素聯(lián)用虎杖白藜蘆醇或槲皮素異構(gòu)體均不能增強(qiáng)抗生素對(duì)MRSA的抑制作用,表現(xiàn)為無關(guān)或拮抗效應(yīng)。而苯唑西林或環(huán)丙沙星與虎杖白藜蘆醇、槲皮素異構(gòu)體聯(lián)合用藥均可增強(qiáng)對(duì)MRSA的抑菌作用,抗生素使用量與單藥相比降低了50%～75%,其中最佳抑菌組合為環(huán)丙沙星聯(lián)用槲皮素異構(gòu)體,聯(lián)用MIC為環(huán)丙沙星25 mg/L,槲皮素異構(gòu)體750 mg/L,抑菌指數(shù)(FIC)為0.5,表現(xiàn)為藥物協(xié)同作用。

有效的抑菌藥物組合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,虎杖白藜蘆醇與苯唑西林或環(huán)丙沙星的聯(lián)合用藥均不會(huì)增加對(duì)小鼠L929細(xì)胞的毒性作用。而槲皮素異構(gòu)體聯(lián)用苯唑西林或環(huán)丙沙星時(shí),小鼠L929細(xì)胞存活率與抗生素單用相比分別降低了8.9%和7.2%,這表明槲皮素異構(gòu)體與兩種抗生素的聯(lián)用對(duì)小鼠的細(xì)胞毒性有所增加。本文為進(jìn)一步研究白藜蘆醇、槲皮素異構(gòu)體聯(lián)用抗生素的抑菌作用和抑菌機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。