不同放牧條件下絨山羊肌肉脂肪代謝和沉積變化的研究

王 宇,王柏輝,楊明陽(yáng),杜 瑞,蘇 琳,趙麗華,田建軍,靳 燁

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古絨山羊是我國(guó)優(yōu)良的絨肉兼用型地方品種,相比綿羊肉,山羊肉脂肪含量低,蛋白含量高,更有益于人體健康,肌內(nèi)脂肪的含量對(duì)肌肉嫩度、風(fēng)味和多汁性具有重要影響,Chartrin等[1]研究表明,胸肌中脂質(zhì)含量從1.7%增加到8.5%會(huì)增加鴨肉的亮度值、黃度值、蒸煮損失、嫩度和風(fēng)味;肉類脂肪酸種類在烹飪過程中的氧化穩(wěn)定性中起著重要作用,影響肉的嫩度、風(fēng)味和多汁性[2]。

目前內(nèi)蒙古絨山羊飼養(yǎng)模式主要有放牧、舍飼和放牧+舍飼三種模式[3]。對(duì)絨山羊的研究主要集中在生產(chǎn)性能和疾病預(yù)防、養(yǎng)殖管理等方面。萬(wàn)里強(qiáng)等[4]研究表明放牧山羊的生產(chǎn)性能受山羊有效的采食量、放牧季節(jié)和可食植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等因素的影響;畢臺(tái)飛等[5]研究表明舍飼山羊的產(chǎn)肉性能優(yōu)于放牧和放牧補(bǔ)飼,而放牧補(bǔ)飼山羊產(chǎn)絨性能高于其他放牧方式,可能是高運(yùn)動(dòng)量和優(yōu)良的牧草造成的。目前,對(duì)絨山羊肌肉脂肪代謝和沉積變化的研究較少。不同放牧區(qū)域牧草的多樣性和新鮮度不同,Scollan等[6]研究表明牧草種類的多樣性和新鮮度及牧草攝入量和攝入時(shí)間的延長(zhǎng)均可增加肌肉中n-3系列多不飽和脂肪酸的沉積。脂蛋白脂酶(lipoprteinlipase,LPL)可水解血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯為游離脂肪酸和甘油,而產(chǎn)生的游離脂肪酸被運(yùn)送到不同組織中氧化供能或作為脂肪合成的原料,對(duì)調(diào)控脂肪沉積具有重要的作用[7];硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)是催化飽和脂肪酸合成單不飽和脂肪酸的限速酶,影響肌肉中脂肪酸的組成,SCD基因的高表達(dá)有利于脂肪的沉積[8]。Zhang等[9]研究表明SCD和LPL基因表達(dá)量的上調(diào),會(huì)提高肌肉中肌內(nèi)脂肪含量的沉積。Dervishi等[10]研究表明羔羊肉中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)、飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的含量和n-6/n-3值與SCD和LPL的基因表達(dá)量密切相關(guān)。

本試驗(yàn)主要通過測(cè)定山地放牧和草地放牧絨山羊的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、肌肉脂肪酸含量和脂肪代謝基因mRNA的表達(dá)量,分析不同放牧條件下絨山羊肌肉的脂肪代謝和沉積變化,并建立脂肪代謝基因與脂肪和脂肪酸沉積間的聯(lián)系,旨在了解絨山羊脂肪沉積規(guī)律和脂肪調(diào)控的機(jī)制,增加肌內(nèi)脂肪和有益脂肪酸的沉積量,減少低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值脂肪含量的沉積,從而提高脂肪的利用率。以期為今后通過調(diào)控脂肪代謝基因的表達(dá)來(lái)提高絨山羊肌內(nèi)脂肪和脂肪酸的沉積,從而為改善羊肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)提供參考,同時(shí)提高對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊這一優(yōu)良的絨肉兼用型地方品種的保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絨山羊的飼養(yǎng) 在陰山山脈中部的大青山地區(qū),氣候類型為典型的溫帶大陸性氣候,年降雨約為380 mm,大青山草原是典型荒漠化草原,山地放牧(1800 m以上)選擇在大青山山腰處,攝食植物包括黃芩、沙棘、秦艽等；草場(chǎng)放牧(1500 m以下) 選擇在大青山地區(qū)的草原上,牧草類型為蒙古蔥、蒺藜、芨芨草、堿韭等[11];甲醇、正己烷(均為色譜純)、三氯甲烷、三氯化硼-乙醚絡(luò)合物、氯化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉、硫酸、無(wú)水乙醚、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;37種脂肪酸甲酯的混標(biāo) Sigma公司;RNase-free 水 北京天根生物技術(shù)有限公司;瓊脂粉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;核酸染料 北京百泰克生物技術(shù)有限公司;焦碳酸二乙酯 Intrivogen公司;RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq? Version2.0、Preme Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMII 大連寶生物工程有限公司。

SXT-02索氏抽提器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;KDY-9830凱氏定氮儀 北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司;KDN-D20D消化爐 上海精隆公司;Trace 1300氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HJ-6型多頭磁力攪拌加熱器 江蘇榮華儀器制造有限;HH-4水浴鍋 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;GRX-9053A 型熱空氣干燥箱、SX2-4-10箱式電阻爐 上海一恒科技有限公司;ZHJH-C1112C超凈臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;Eppendorf5430R低溫臺(tái)式冷凍離心機(jī) 北京百晶生物科技有限公司;BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京百晶生物科技有限公司;Mini-sub Cell GT Cel水平電泳槽、GelDoc XR+凝膠成像分析儀、CFX96TM Real-TimePCR儀 美國(guó)Bio-rad;Veriti PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在內(nèi)蒙古土默特左旗大青山牧區(qū),隨機(jī)選擇草場(chǎng)放牧和山地放牧條件下發(fā)育正常、健康的1.5歲絨山羊各12只,將該24只絨山羊屠宰后,取背最長(zhǎng)肌50 g于-20 ℃保藏待用,取背最長(zhǎng)肌10 g于液氮中保存,并置于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保藏待用。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的測(cè)定 肌肉中蛋白質(zhì)根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.5-2016[12]采用凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定;肌肉中水分根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.3-2016[13]采用直接干燥法進(jìn)行測(cè)定;肌肉中脂肪根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.6-2016[14]采用索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定;肌肉中灰分根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.4-2016[15]采用直接灰分法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 羊肉中脂肪酸的測(cè)定 根據(jù)王柏輝等[16]的方法對(duì)脂肪酸進(jìn)行提取:稱取碎肉樣5 g并加氯仿-甲醇混合液(2∶1,V/V),振搖2 h,浸泡過夜后用G3漏斗過濾,濾液中加5 mL 20%氯化鈉溶液,靜止分層,下層的氯仿層即為脂肪提取液。經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到脂肪。然后加0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇溶液5 mL,70 ℃回流5 min,進(jìn)行脂肪皂化,隨后加5 mL三氟化硼乙醚溶液,70 ℃回流2 min,進(jìn)行脂肪甲酯化。最后加2 mL正己烷,70 ℃回流1 min,再加5 mL飽和NaCl溶液,靜置10 min,吸取1 mL正己烷層用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中,進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜條件:色譜柱:反式色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm),載氣為氦氣,載氣流速為1 mL/min,進(jìn)樣口溫度:240 ℃,進(jìn)樣量為1 μL,分流比為100∶1。采用程序升溫:初始溫度為60 ℃,保持1 min,然后以20 ℃/min的速度升至120 ℃,保持1 min;再以5 ℃/min的速度升至240 ℃,保持15 min。

MS條件:離子源溫度為300 ℃,傳輸線溫度240 ℃,質(zhì)量掃描范圍50～500 (m/z),溶劑延遲時(shí)間:4 min。

1.2.4 引物合成 引物序列如表1,LPL、SCD 由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成,β-action作為管基因。

表1 實(shí)時(shí)定量引物

1.2.5 脂肪基因表達(dá)量的測(cè)定

1.2.5.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 稱取適量樣品于干凈的研缽中,多次加液氮且研磨樣品至粉狀用于RNA提取,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的質(zhì)量。樣品RNA的最終濃度均為500 ng/μL。使用RT-qPCR的試劑盒將提的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA[8],最后置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 實(shí)時(shí)定量PCR 本試驗(yàn)按照CFX96TM Real-Time PCR Detection System進(jìn)行操作。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,使用CFX96TM Real-Time PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如表2所示。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃,30 s;變性95 ℃,5 s,退火60 ℃,30 s,延伸72 ℃,30 s(變性、退火和延伸35個(gè)循環(huán));延伸72 ℃,10 min。

1.2.6 相關(guān)性分析 相關(guān)性采用SPSS 19.0 軟件中的雙變量相關(guān)分析(Pearson),在SPSS中導(dǎo)入變量數(shù)據(jù),依次點(diǎn)擊“分析-相關(guān)-雙變量”,選擇變量導(dǎo)入變量框,并勾選Pearson選項(xiàng)框進(jìn)行分析,顯著性p<0.05表示相關(guān)性顯著,p<0.01表示相關(guān)性極顯著。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Excel 2003軟件進(jìn)行圖表處理。差異性采用單因素方差(One Way ANOVA)分析進(jìn)行LSD和Duncan多重比較,相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析(Pearson)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放牧條件下絨山羊營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的差異性分析

由表3可知,不同放牧條件下絨山羊的水分、灰分和蛋白質(zhì)的含量均無(wú)顯著差異(p>0.05),而山地組肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量顯著高于草地組(p<0.05),這可能與山羊攝入的牧草類型和活動(dòng)量不同有關(guān),蔣建生[17]研究表明坡度40度以上的草地雜草繁茂,灌叢居多,在陡坡草地上山羊表現(xiàn)得比在平緩草地上更活躍且食欲更旺盛。逯來(lái)章等[18]研究表明高海拔地區(qū)低氧寒冷,藏羊皮下脂肪層厚,可以增強(qiáng)御寒能力。趙國(guó)華等[19]研究表明亞高山草甸草地是優(yōu)質(zhì)的放牧地,雖然產(chǎn)草低,但草質(zhì)好,適口性好,營(yíng)養(yǎng)豐富,具有顯著的“三高一低”(粗脂肪高)的特點(diǎn)。本試驗(yàn)的絨山羊肌內(nèi)脂肪含量約在3.99%～5.61%之間,Hopkins等[20]研究指出就羊肉的肌內(nèi)脂肪范圍,感官性狀模型指出最高脂肪水平(18%)總體喜愛程度比最低脂肪水平(2%)高出13%,并且消費(fèi)者滿意的肌內(nèi)脂肪含量最低為5%,這與山地組肌內(nèi)脂肪含量更為接近。汪踔[21]研究表明肌內(nèi)脂肪含量影響肉的多汁性、嫩度和風(fēng)味,適度的脂肪沉積使肌肉細(xì)嫩多汁,香味濃郁。

表3 不同放牧條件下絨山羊營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的差異性分析

2.2 不同放牧條件下絨山羊肌肉中脂肪酸含量的差異性分析

由表4可知,草地組及山地組絨山羊肌肉中脂肪酸主要以棕櫚酸、硬脂酸和油酸為主,分別為92.42%、87.88%，其含量油酸>棕櫚酸>硬脂酸的趨勢(shì),這與王柏輝等[16]對(duì)蘇尼特羊的研究結(jié)果一致,但絨山羊三種脂肪酸的總比例高于蘇尼特羊,原因可能是品種不同導(dǎo)致的。草地組單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)含量顯著高于山地組(p<0.05);山地組PUFA含量顯著高于草地組(p<0.05)；SFA含量在兩組中無(wú)顯著差異(p>0.05)。

表4 不同放牧條件下絨山羊肌肉中脂肪酸組成的差異性分析

在SFA中,兩種放牧條件下絨山羊肌肉中SFA均以棕櫚酸和硬脂酸為主,草地組癸酸含量顯著高于山地組(p<0.05);其他脂肪酸含量在兩組中差異均不顯著(p>0.05)。

在MUFA中,山地組反油酸含量顯著高于草地組(p<0.05);草地組油酸含量顯著高于山地組(p<0.05),王志武等[22]研究表明油酸能降低膽固醇在血液中的含量,減少其在血管上的沉積,有預(yù)防動(dòng)脈硬化的作用;豆蔻油酸和棕櫚油酸含量在兩組中無(wú)顯著差異(p>0.05)。

在PUFA中,山地組反亞油酸、亞油酸、α-亞麻酸和CLA的含量均顯著高于草地組(p<0.05),這可能與山羊攝入的牧草類型和活動(dòng)量的不同有關(guān)。張東杰[23]研究表明天然草地各類型中高寒草原類牧草飼料品質(zhì)最好,其次是低平地草甸類、高寒草甸類、溫性荒漠類、溫性荒漠草原類、溫性草原類,表明山地牧草品質(zhì)優(yōu)于草地牧草。山地組絨山羊的運(yùn)動(dòng)量大于草地組,漆艷娥等[24]研究表明運(yùn)動(dòng)能增加腸道菌群的多樣性,厚壁菌門和瘤胃球菌含量增加,擬桿菌門和乳酸桿菌科含量下降。王柏輝等[25]研究表明羊肉中CLA和α-亞麻酸與瘤胃球菌屬存在顯著正相關(guān),而與擬桿菌屬存在顯著負(fù)相關(guān);反油酸與擬桿菌屬存在顯著負(fù)相關(guān),這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。兩組的CLA含量有差異可能與瘤胃微生物群體的損傷以及SCD基因表達(dá)的抑制有關(guān)[26]。亞油酸作為風(fēng)味物質(zhì)分解合成的重要底物,對(duì)羊肉的風(fēng)味形成起著重要作用[27]。亞麻酸具有降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和益智等作用。趙天章[28]研究表明羊肉中含有高含量的CLA,遠(yuǎn)高于豬肉和禽類,是人類獲得CLA的主要食物來(lái)源之一。草地組花生三烯酸和花生四烯酸的含量均顯著高于山地組;Urrutia等[29]研究表明飼喂高水平的α-亞麻酸會(huì)降低肌肉組織中花生三烯酸和花生四烯酸的含量,但低水平的α-亞麻酸飲食會(huì)增加花生四烯酸的含量。山地組二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid,DHA)含量顯著高于草地組(p<0.05),而二十碳五烯酸(docosahexenoic acid,EPA)含量在兩組中無(wú)顯著差異(p>0.05)。EPA和DHA具有降血膽固醇、提高人體免疫力、增加肌肉重量和減少脂肪組織等有益功能[30]。畜禽肉的脂肪酸組成受飲食中脂肪酸組成的影響,產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是山地牧草中含有的n-3PUFA含量高于草地組,使山地山羊肌肉中沉積較多的α-亞麻酸。Scollan等[6]研究表明草類植物含有高比例的(50%～75%)總脂肪酸為α-亞麻酸,而α-亞麻酸的延長(zhǎng)和去飽和作用會(huì)增加肌肉中EPA和DHA的合成。兩組的EPA含量無(wú)顯著差異可能是由于α-亞麻酸向其長(zhǎng)鏈PUFA產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率是有限的[31]。山地組n-3 PUFA顯著高于草地組(p<0.05);山地組n-6/n-3 PUFA值顯著低于草地組(p<0.05),比值為3.34,符合營(yíng)養(yǎng)專家的推薦值n-6/n-3 PUFA≤4[26]。n-6/n-3PUFA值是影響人體健康的重要因素,Simopoulos[32]研究表明飲食中適當(dāng)?shù)膎-6/n-3 PUFA值能預(yù)防人類許多慢性疾病的發(fā)生,如心血管疾病,癌癥以及炎癥和自身免疫疾病等,這進(jìn)一步表明山地放牧組羊肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

2.3 不同放牧條件下肌肉中脂肪代謝基因的表達(dá)量

SCD和LPL是調(diào)控機(jī)體脂肪沉積的重要因子。由圖1可知,草地組SCD基因表達(dá)量顯著高于山地組(p<0.05);而山地組LPL基因表達(dá)量顯著高于草地組(p<0.05),推測(cè)原因可能與牧草類型和所處環(huán)境有關(guān)。相比草地牧草,山地牧草類型多樣且營(yíng)養(yǎng)豐富,使得山地組絨山羊攝入較多的n-3 PUFA,研究表明飲食中高水平的n-3 PUFA會(huì)抑制SCD酶的表達(dá)活性[33]。相比草地,山地較為寒冷,楊莉[34]研究表明寒冷應(yīng)激后阿勒泰羊和湖羊各組織中LPL的表達(dá)量均顯著得升高。Bahnamiri等[35]研究表明相對(duì)于飽和脂肪酸,高的SCD mRNA豐度能導(dǎo)致更多的不飽和脂肪酸的合成,主要使棕櫚酸和硬脂酸去飽和形成棕櫚油酸和油酸[36],這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。LPL基因在控制肌肉組織和脂肪組織之間的三?；视头峙渲衅痍P(guān)鍵作用[33]。

圖1 不同放牧條件下SCD和LPL基因的表達(dá)量

2.4 脂肪代謝基因與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量的相關(guān)性分析

由表5可知,SCD 和LPL基因的表達(dá)量均與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān),且LPL基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)(p<0.05),相關(guān)系數(shù)為0.587。與Wang等[37]和Jeong等[38]的研究結(jié)果一致,說(shuō)明SCD和LPL基因高表達(dá)有利于肌內(nèi)脂肪沉積。SCD基因表達(dá)量與MUFA含量呈顯著正相關(guān)(p<0.05),與Wang等[37]研究結(jié)果一致,在不飽和脂肪酸合成中SCD基因起著重要的作用,可將SFA轉(zhuǎn)化為MUFA。LPL基因表達(dá)量與PUFA呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),與SFA呈正相關(guān),這與田佳[39]的研究結(jié)果一致。有研究表明高含量的PUFA能夠干擾生脂酶LPL基因的轉(zhuǎn)錄和破壞其mRNA的穩(wěn)定性,進(jìn)而會(huì)抑制LPL基因的表達(dá)[40]。祝仁鑄[41]研究表明LPL酶活性的增加,會(huì)促使脂肪酸再生能力的增加,更有利于脂肪的沉積。通過相關(guān)性可以證實(shí)SCD和LPL基因?qū)τ谘蛉獾闹境练e和脂肪酸組成是重要的,并且這些基因的評(píng)估和使用可以用于改善羊肉的質(zhì)量。

表5 脂肪代謝基因與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

山地組肌內(nèi)脂肪含量顯著高于草地組(p<0.05)。在脂肪酸含量方面,山地組中多不飽和脂肪酸的含量顯著高于草地組,特別是α-亞麻酸、DHA和CLA(p<0.05),且山地組n-6/n-3 PUFA比值為3.34,說(shuō)明山地組絨山羊的肌內(nèi)脂肪含量分布合理,且山地羊肉具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

在調(diào)控脂肪代謝的基因中,草地組SCD基因的表達(dá)量顯著高于山地組(p<0.05);而山地組LPL基因的表達(dá)量顯著高于草地組(p<0.05);通過相關(guān)性分析可知,SCD基因的高表達(dá)能促進(jìn)MUFA的沉積;LPL基因高表達(dá)能促進(jìn)肌內(nèi)脂肪的沉積,但卻會(huì)抑制肌肉中PUFA的沉積。因此,未來(lái)可通過調(diào)控SCD和LPL基因的表達(dá)來(lái)改善畜禽肉中脂肪和脂肪酸含量的沉積,從而提高羊肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)。