石韋內(nèi)生真菌SW-7產(chǎn)黃色素的發(fā)酵條件

裴梟鑫，吳迪，李玉芳，袁彥彥，劉俊林*

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730110； 2.西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730110)

隨著人們對食品安全的注重和對健康意識的提高，天然色素越來越受人們的關(guān)注和喜愛，其中黃色素約占市場需求量的60%以上。目前，市場上常見的黃色素產(chǎn)品多以植物提取為主(如姜黃素、南瓜黃、梔子黃等)，但易受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等許多因素的影響[1]。微生物作為正在開發(fā)的新興資源它將擁有很大的研究空間，目前已發(fā)現(xiàn)多種菌可產(chǎn)黃色素，如趙靖等[2]發(fā)現(xiàn)，紅曲霉具有產(chǎn)紅曲黃色素的能力。楊柳等[3]發(fā)現(xiàn)，粒毛盤菌可產(chǎn)黃色素并研究了其色素的穩(wěn)定性。左勇等[4]在研究P.agaridevorans紅色素時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌具有產(chǎn)黃色素的能力。今從藥用植物石韋葉中分離純化得到產(chǎn)黃色素真菌，可作為黃色素的新型來源。

真菌廣泛存在于自然界，在長期進(jìn)化中，一些真菌尋找到理想的生活環(huán)境——植物體，進(jìn)入植物體并和諧地與之生活在一起，成為植物體微生態(tài)系統(tǒng)的組成部分。它們生活在植物的根、莖、葉等器官的組織內(nèi)部，但一般不引發(fā)植物體病害，這些真菌被稱之為內(nèi)生真菌[5]，內(nèi)生真菌因其生于植物體內(nèi)部，故不同于別種真菌，其賦予產(chǎn)特殊產(chǎn)物的能力的幾率更大，因此備受關(guān)注[6]，目前研究已發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌具有產(chǎn)抑菌[7]、抗腫瘤[8]、防線蟲[9]、抗氧化[10]等功能產(chǎn)物的能力，更是很多天然產(chǎn)物的新來源。

石韋又名石皮、金星草、石蘭，味甘苦，性微寒，歸肺、膀胱經(jīng)，能利尿通淋、清肺止咳、涼血止血，用于熱淋、血淋、石淋、小便不利、淋瀝澀痛、肺熱咳嗽、吐血、衄血、尿血、崩漏等癥狀。石韋中主要含有里白烯、β-谷甾醇、綠原酸、杧果苷、槲皮素、異杧果苷、異槲皮素、蔗糖等多種成分[11]。該真菌是從石韋干葉中分離得到的1株菌，在其生長過程中產(chǎn)生大量的黃色素，且性質(zhì)相對穩(wěn)定。天然色素研究受到大家的重視，但對真菌產(chǎn)黃色素的研究少有報(bào)道。本試驗(yàn)對產(chǎn)黃色素真菌(SW-7)生長條件進(jìn)行初步分析，對該真菌深層發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

從石韋內(nèi)分離得到1株內(nèi)生真菌。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基。200 g土豆切小塊煮沸30 min，擠壓過濾，濾液中加20 g葡萄糖。

大米培養(yǎng)基。大米粉20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，NaNO32 g，KH2PO41.5 g，MgSO41 g。

查氏合成培養(yǎng)基。蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g。

高氏培養(yǎng)基?？扇艿矸?0 g，NaCl 0.5 g，KNO31.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g。

以上培養(yǎng)基均完全溶解后添加蒸餾水定容至1 000 mL。在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

將內(nèi)生真菌(SW-7)接種至平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 d，用滅菌接種環(huán)輕刮菌體表面，釋放孢子。10 mL孢子液接種至100 mL種子液培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)36 h。

1.2.2 黃色素發(fā)酵培養(yǎng)基選擇

向4種50 mL菌體培養(yǎng)基中分別接入5 mL種子液，在28 ℃、160 r·min-1暗培養(yǎng)發(fā)酵，顏色穩(wěn)定后進(jìn)行發(fā)酵物分離、色素吸光值(D)測定和生物量測定。

1.2.3 深層發(fā)酵試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)

在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇PDA液體培養(yǎng)基為發(fā)酵底物，以菌體生物量、黃色素為目的物，設(shè)轉(zhuǎn)速(A)、pH值(B)、溫度(C)和發(fā)酵時(shí)間(D)四因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1～4水平：A分別為140、150、160、170 r·min-1；B分別為5、6、7、8；C分別為26、28、30、32 ℃；D分別為6、8、10、12 d。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)生菌體生物量的測定

將達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液5 000 r·min-1離心10 min后去上清液，沉淀用滅菌水洗滌2遍，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，分析天平準(zhǔn)確稱量得到菌絲體質(zhì)量，即為發(fā)酵產(chǎn)生菌體的生物量[12]。

1.2.5 黃色素發(fā)酵原液吸光度的測定

參照文獻(xiàn)[13]稍作修改，準(zhǔn)確取一定體積發(fā)酵原液濾液將達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液5 000 r·min-1離心10 min后取上層液，稀釋至一定倍數(shù)，并于375 nm所測得的最大吸收峰處測D值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SW-7在不同培養(yǎng)基中生長狀況

如表1所示，SW-7在PDA培養(yǎng)基中菌絲體產(chǎn)量最多，色素產(chǎn)量也最大；SW-7在大米培養(yǎng)基中的生物量和色素量皆僅次于PDA；在查氏培養(yǎng)基中菌株長勢雖好，但不適用于黃色素的深層發(fā)酵；在高氏培養(yǎng)基中色澤偏黃綠色，影響了色素色澤，故在后期正交試驗(yàn)中使用PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行SW-7的發(fā)酵條件研究。

表1 SW-7菌株在4種培養(yǎng)基中生長狀況

2.2 SW-7菌體在深層發(fā)酵的表現(xiàn)

由表2可知，培養(yǎng)溫度(F值=15.426*)和發(fā)酵時(shí)間(F值=20.400*)對SW-7黃色素產(chǎn)量影響亦顯著。根據(jù)F值大小得出4個(gè)因素對SW-7菌體產(chǎn)量影響大小次序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH值(F值=2.101)、轉(zhuǎn)速(F值=1.341)；根據(jù)K值得出以真菌菌體產(chǎn)量為目的物的最佳組合為A3B1C3D3，即轉(zhuǎn)速160 r·min-1、初始pH值5、溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間10 d。在此條件下通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可得，搖瓶發(fā)酵菌體產(chǎn)量為7.68 g·L-1，色于此條件下發(fā)酵產(chǎn)色素。本試驗(yàn)?zāi)康氖翘岣呱禺a(chǎn)素吸光度為1.716，表明真菌SW-7最適量，故以A3B1C3D3方案為最終發(fā)酵最佳條件。

表2 SW-7深層發(fā)酵正交試驗(yàn)直觀分析

3 小結(jié)

通過對比SW-7在不同培養(yǎng)基中生長狀況和產(chǎn)色素能力發(fā)現(xiàn)，SW-7較適合于PDA培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基；SW-7在天然培養(yǎng)基中生長較合成培養(yǎng)基更快更好，分泌產(chǎn)物能力更強(qiáng)，在PDA培養(yǎng)基上分泌色素色澤偏深黃，而在大米培養(yǎng)基則為金黃色。選擇PDA培養(yǎng)基來深層發(fā)酵石韋內(nèi)生真菌SW-7黃色素，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方式綜合分析影響本菌分泌色素的因素，從而達(dá)到優(yōu)化該菌發(fā)酵產(chǎn)黃色素的發(fā)酵方案，得出適合于SW-7產(chǎn)生黃色素物質(zhì)的基本條件為轉(zhuǎn)速160 r·min-1、pH值5、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間10 d。經(jīng)過二次試驗(yàn)驗(yàn)證，在該條件下，真菌菌體為7.68 g·L-1，色素吸光度為1.716。通過本試驗(yàn)的條件優(yōu)化，SW-7色素產(chǎn)量明顯增大，為SW-7真菌色素的利用提供理論依據(jù)。