銀杏葉斑病病葉中黃酮含量變化研究

朱淼 王緒英 翁貴英 張曉勇 嚴(yán)凱

摘要 [目的]研究銀杏葉斑病病葉中黃酮含量的變化。[方法]選擇患不同程度銀杏葉斑病的銀杏病葉，采用乙醇浸提法提取葉中黃酮，同時用紫外分光光度法測定葉中黃酮含量，探討黃酮在葉斑病致病過程中含量變化規(guī)律，確定患葉斑病葉片是否適合采摘再利用，同時也為闡明黃酮在葉斑病致病過程中是否可能起到抵抗病原菌侵染作用提供初步研究。[結(jié)果]隨著葉斑病患病程度的加深，葉片上侵染面積的增大，葉中黃酮含量有所增加;但當(dāng)損傷達(dá)到一定程度時，黃酮含量不再增加。[結(jié)論]患病程度輕的銀杏葉片具有采摘再利用的價值，同時因為黃酮具有較強的抗菌活性，說明黃酮含量升高可能是銀杏葉抵抗葉斑病病原菌侵染機制之一。

關(guān)鍵詞 銀杏;葉斑病;黃酮;含量變化

中圖分類號 R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0182-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.056

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Change of Flavonoids Content in Ginkgo Leaf with Leaf Spot Disease

Abstract [Objective]The research aimed to study the change of flavonoids content in ginkgo leaf with leaf spot disease.[Method]Total flavonoids from ginkgo leaves with different degrees of leaf spot disease were exerted by ethanol extraction method.And flavonoids contents were determined by ultraviolet spectrophotometry.The purpose of this study was to explore the variation regularity of flavonoids contents in the pathogenicity of leaf spot disease， and determine whether the ginkgo leaves with leaf spot disease were suitable for picking and reusing， and whether the flavonoids play a role in opposing the pathogen invasion.[Result]With progressively worse of leaf spot disease， the area of leaf infection increased and the content of flavonoids in leaves increased， but when the damage reached a certain extent， the flavonoids contents did not increase anymore.[Conclusion]The ginkgo leaves with mild illness had the value of harvesting.And as the flavonoids had strong antimicrobial activity， it also indicated that the flavonoids contents might be one of antibacterial mechanisms to leaf spot pathogens.

Key words Ginkgo;Leaf spot diease;Flavone;Content change

基金項目

貴州省科技廳聯(lián)合基金項目（黔科合LH字〔2014〕7469號）;貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（黔科合J字LKLS〔2013〕09號）;六盤水市科技計劃項目（52020-2015-02-03）;六盤水師范學(xué)院科學(xué)研究計劃項目（LPSSY201805）。

作者簡介 朱淼（1987—），女，遼寧本溪人，實驗師，碩士，從事天然產(chǎn)物生物活性研究。*通信作者，碩士，從事植物保護(hù)學(xué)研究。

收稿日期 2018-12-21;修回日期 2019-01-10

銀杏（Ginkgo biloba L.）屬于銀杏科（Ginkgoaceae）銀杏屬（Ginkgo）落葉喬木，被譽為“植物界熊貓”和“植物活化石”，同時也是一味傳統(tǒng)中藥，始載于《日用本草》，在《本草品匯精要》和《本草綱目》中均有記載，尤其銀杏葉，藥用歷史已達(dá)600余年[1]?，F(xiàn)代研究表明，銀杏葉具有改善心腦血管循環(huán)[2]、改善神經(jīng)退行性疾病[3]、抗菌[4]、抗病毒[5-6]、抗氧化[7]等藥理作用，具有較高的藥用價值。

銀杏葉斑病是銀杏葉的一種常見疾病，主要是由真菌侵染引起。病害始發(fā)于銀杏葉片邊緣，隨病情發(fā)展逐步形成扇形或楔形的褐色病斑，病情嚴(yán)重時呈現(xiàn)灰褐色，且在葉片上形成黑色斑點。此病嚴(yán)重危害銀杏葉片健康，損害銀杏產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益。

黃酮是銀杏葉中主要的生物活性成分，抗菌作用明確。Koskimki等[8]研究表明當(dāng)越桔受到侵染時，會激活某些基因合成黃酮;而Feucht等[9]證明在病蟲害侵染時，細(xì)胞周圍會出現(xiàn)黃酮的積累，這種積累會進(jìn)一步對病蟲害形成防御屏障。他們的研究說明，在植物受到病害侵染時，黃酮含量的升高可能作為其抵抗病原侵染的機制之一。同時，黃酮作為銀杏葉中主要的生物有效成分，其在葉片中的含量是銀杏葉采摘的重要指標(biāo)。

筆者通過比較健康葉片、機械損傷葉片、患有不同程度葉斑病葉片及患病葉片中未被侵染部分的黃酮含量，探討銀杏葉斑病發(fā)病過程中黃酮含量變化規(guī)律，確定患病葉片是否適合采摘再利用;同時鑒于黃酮的抗菌作用，也為探明黃酮是否是銀杏葉抵抗葉斑病侵染機制提供初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器。

自動脫帽離心機（型號TD5脫帽型，湖南赫西儀器裝備有限公司）;雙孔水浴鍋（型號HH-2，北京科偉永興儀器有限公司）;紫外可見分光光度計（型號UV-2100，北京東西分析儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號BGZ-30，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器設(shè)備廠）。

1.1.2 研究對象及試劑。試驗用銀杏葉選取貴州省六盤水市明湖公園內(nèi)銀杏樹的健康葉片及患有不同程度銀杏葉斑病的葉片。將采集的葉片烘干后，分為6組，分別是健康組、損傷組、病葉組Ⅰ、病葉組Ⅱ、病葉組Ⅲ和對照組。其中，健康組是指沒有患病的銀杏葉健康葉片;損傷組是指在葉片采摘前，將葉片人為進(jìn)行物理損傷，2 d后，再進(jìn)行采摘，試驗時取葉片損傷區(qū)域的1～2 mm部分;病葉組是指患有銀杏葉斑病的葉片，試驗時取葉片被侵染區(qū)域的1～2 mm部分，其中病葉組 Ⅰ 是指患病面積較小，剛形成病斑的葉片，病斑直徑大約是1 mm;病葉組 Ⅱ 指患病面積稍大，形成病斑直徑大約1 cm;病葉組Ⅲ是指患病面積較大，已經(jīng)形成嚴(yán)重?fù)p傷的葉片（圖1）。對照組是指取患有銀杏葉斑病葉片中未被侵染的部分，即患病葉片的健康部分。每組做3個重復(fù)。槲皮素購于中國食品藥品檢定研究院，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 葉斑病病原菌鑒定。

在顯微鏡下，挑取病葉處菌落，取干凈的載玻片，滴加一小滴蒸餾水，將顯微鏡下挑取的菌落放入蒸餾水中，再用蓋玻片進(jìn)行壓片處理，進(jìn)行菌落鑒定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

稱取槲皮素0.020 8 g，用70%的乙醇溶液溶解，并定溶至100 mL，配成濃度為208 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別稀釋為52.0、26.0、13.0、6.3、0 μg/mL，在360 nm處用分光光度計測出吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 黃酮提取。

將采集的銀杏葉健康葉片及葉斑病葉片等各組葉片在通風(fēng)處放置15 d，用80 ℃的烘箱烘烤約2 h后取出備用。用剪刀將健康組、損傷組、病葉組Ⅰ、病葉組Ⅱ、病葉組Ⅲ及對照組的葉片分別剪碎，用研缽研磨，并每組各稱取1 g葉片，用70%的乙醇按料液比1∶30的比例浸泡，封好試劑瓶的瓶口，在80 ℃的水浴鍋中加熱2 h，期間并不斷搖晃混勻。離心5 000 r/min，20 min，收集上清。

1.2.4 黃酮含量檢測。

準(zhǔn)確量取各組樣品液5 mL放于試管中，用分光光度計分別測出樣品液吸光度，并利用已繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品黃酮含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 試驗數(shù)據(jù)用Prism5軟件對各組樣品中黃酮含量值進(jìn)行配對T檢驗分析，若P值小于0.05則表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要病原菌 如圖2所示，經(jīng)過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，銀杏葉斑病主要病原菌是盤二孢，還發(fā)現(xiàn)部分蠕孢屬菌落。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

依據(jù)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度對吸光度做圖，繪制出如圖3所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時建立黃酮吸光度Y和標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度X的線性回歸方程：Y=0.043 9X-0.068 4（R2=0.994 8）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度之間有較好的線性關(guān)系。

2.3 黃酮含量變化 該研究對健康組、損傷組、對照組和患不同程度葉斑病銀杏葉片中黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明（圖4），所有組中病葉組與健康組之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），其中病葉組Ⅱ的平均黃酮含量最高，為31.85 mg/g;而損傷組、對照組與健康組之間沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。通過試驗發(fā)現(xiàn)，隨著銀杏葉受葉斑病侵染程度的逐漸加重，黃酮含量有一定的升高，但當(dāng)葉片達(dá)到一定的損傷程度時，黃酮含量不再升高，甚至有輕微降低?？赡苁钱?dāng)葉斑病剛侵染葉片時，銀杏葉細(xì)胞感受到外來菌類的攻擊，便在感染部位的周圍形成黃酮積累，抵抗菌類侵襲。隨著感染程度加重，黃酮含量積累也有一定增加，但當(dāng)損傷達(dá)到一定程度時，已經(jīng)嚴(yán)重破壞葉片的組織細(xì)胞，黃酮含量不再增加。銀杏葉愈傷組織中黃酮含量可能會有所增加[10]，因此，病葉組黃酮含量增加一方面可能是由于銀杏葉抵抗葉斑病病原菌侵染，而另外一個原因可能是由于葉片形成損傷而引起的黃酮積累。

3 討論與結(jié)論

黃酮是銀杏葉中主要的生物活性物質(zhì)，其在銀杏葉中的含量是銀杏葉采摘的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，患有病害的銀杏葉不再具有采摘利用的價值。葉斑病是銀杏常見病害，對銀杏傷害較大。為探求患有葉斑病的銀杏葉是否具有采摘再利用價值，該研究對患有銀杏葉斑病的葉片中黃酮含量加以比較分析。

研究過程中，設(shè)置了未患病葉片的健康組和患不同程度葉斑病的葉片分組。鑒于曾有報道愈傷組織中黃酮含量會有所升高[10]，為了更加準(zhǔn)確地分析葉斑病對銀杏葉中黃酮含量的影響，又設(shè)置了進(jìn)行人為機械損傷的損傷組;同時為了確定在葉斑病侵染銀杏葉過程中，是否只有患病處黃酮含量受到影響，增設(shè)了患病但無侵染部分的對照分組。研究設(shè)立多個分組進(jìn)行分析，對問題的認(rèn)識較為全面，同時得到的試驗結(jié)論也更為準(zhǔn)確。

研究結(jié)果表明，損傷組和對照組相比健康組而言，黃酮含量并無顯著統(tǒng)計學(xué)差異;而患病葉片中黃酮含量相比健康組葉片中黃酮含量有所增加，且具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，說明在銀杏葉斑病發(fā)病過程中被侵染細(xì)胞周圍形成的黃酮含量會有所積累，而這種積累并不是由于機械損傷引起;同時研究結(jié)果還表明，在葉斑病發(fā)病過程中，葉片黃酮含量會有所增加，但病情嚴(yán)重時，黃酮含量則不會再繼續(xù)增加?？傊?，患銀杏葉斑病病情較輕的葉片仍具有采摘再利用的價值;同時因黃酮具有抗菌性，黃酮的這種積累也很可能是銀杏葉抵御葉斑病病原菌侵染的機制之一。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊光.再論科研開發(fā)銀杏資源的重要意義[J].北京中醫(yī)藥，2008，27（6）：463-466.

[2] 鄒月.銀杏葉提取物對心腦血管藥理作用的研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2017，36（18）：122-123.

[3] 曾常明，趙薇，丁寧，等.銀杏葉提取物對神經(jīng)退行性疾病作用機制的研究進(jìn)展[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2013（8）：21-24.

[4] WU Y，PARK K C，CHOI B G， et al.The antibiofilm effect of Ginkgo biloba extract against salmonella and listeria isolates from poultry [J].Foodborne Pathog Dis， 2016，13（5）：229-238.

[5] HARUYAMA T，NAGATA K.Antiinfluenza virus activity of Ginkgo biloba leaf extracts [J].J Nat Med，2013，67（3）：636-642.

[6] WANG C Z，LI W J，TAO R.Antiviral activity of a nanoemulsion of polyprenols from ginkgo leaves against influenza A H3N2 and hepatitis B virus in vitro [J].Molecules，2015，20（3）：5137-5151.

[7] ZHAO L J， LIU W， XIONG S H， et al.Determination of total flavonoids contents and antioxidant activity of Ginkgo biloba leaf by nearinfrared reflectance method [J].Int J Anal Chem， 2018， 2018：1-7.

[8] KOSKIMKI J J，HOKKANEN J，JAAKOLA L，et al.Flavonoid biosynthesis and degradation play a role in early defence responses of bilberry （Vaccinium myrtillus） against biotic stress [J].European journal of plant pathology，2009，125：629-640.

[9] FEUCHT W，TREUTTER D，SCHWALB P.Principles of barrier formation of scab infected fruits [J].Z Pflanzenkr Pflanzenpathol Pflanzenschutz， 1998，105（4）：394-403.

[10] 陳學(xué)森，鄧秀新，章文才.銀杏組織培養(yǎng)與黃酮生產(chǎn)的研究I.銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)與褐變調(diào)控的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997，30（6）：55-60.