山西中部4型禽腺病毒遺傳進化及其分離毒株致病性分析

劉 璐，王 晨，張 丹，高 宇，程 宇，譚世明，梁立濱，馬海利

（山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 太谷 030801）

禽心包積水-包涵體肝炎綜合征（Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH）是一種主要由4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus-4，F(xiàn)Ad V-4）引起的高度傳染性和高死亡率的新型家禽疾病[1]。2013年，HPS-IBH開始在我國部分地區(qū)流行，2015年在河南、山東、山西、江蘇、安徽等省份暴發(fā)并傳入其他省份[2]。該病多發(fā)于4~10周齡的雞，感病雞通常無明顯癥狀而突然死亡，死亡率為10%[3]；剖檢死雞可見肝臟腫脹，質(zhì)地脆弱易破裂，呈點狀或斑點狀出血，并有土黃色壞死灶，心包積水嚴重[4]。

禽腺病毒可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，F(xiàn)AdV-4屬于禽腺病毒Ⅰ群[5]。Hexon蛋白是禽腺病毒的主要抗原蛋白，具有型、型間、組特異性抗原表位和中和性抗原表位，可與抗體結合，是禽腺病毒的典型結構蛋白[6]，對診斷和預防Ⅰ群禽腺病毒感染有重要意義[7-9]。FAdV-4有2個Fiber蛋白，即Fiber-1和Fiber-2，其中Fiber-2蛋白比Fiber-1蛋白免疫活性更高[10]。Fiber-2蛋白的羧基端頭部區(qū)域是特異性受體的結合位點，是病毒早期吸附宿主細胞的必需位點，具有抗原性，可用于研制表位疫苗[11]。

目前，關于山西禽腺病毒4型的研究，僅見陸冰洋等[12]對山西省某養(yǎng)雞場4型禽腺病毒研究。本研究對山西中部地區(qū)的太谷、祁縣、介休、臨汾、長治、交城、柳林等養(yǎng)雞場11份疑似心包積水-肝炎綜合征病雞的肝臟進行了FAd V-4的PCR檢測，并對陽性樣品進行了Hexon蛋白和Fiber-2蛋白全基因序列擴增、測序和分析，用雞肝癌細胞（LMH）對陽性樣品進行了FAd V-4病毒分離，研究病毒對SPF雞胚和SPF雞的致病性，旨在為山西省FAd V-4感染防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2020年采集山西中部地區(qū)的太谷、祁縣、介休、臨汾、長治、交城、柳林等養(yǎng)雞場11份疑似心包積水-肝炎綜合征病雞的肝臟組織樣品，-20℃保存?zhèn)溆?；LMH保存于山西農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)傳染病實驗室；TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒購自哈爾濱世紀元亨生物藥業(yè)有限公司。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)Gen Bank中發(fā)表的Ⅰ群禽腺病毒代表毒株FAdV-4 GC株（登錄號：EU177544.1），使用Primer Premier 5.0軟件設計用于FAd V-4陽性病料的檢測引物和擴增FAd V-4的Hexon、Fiber-2基因全長的引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3 病毒DNA提取

取樣品組織，按1∶2比例加PBS勻漿，反復凍融3次，5 000 r/min離心30 min，上清用0.22μm濾器過濾，參照TIANamp Genomic DNA Kit說明書提取樣品病毒DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病料PCR鑒定

以提取的病毒DNA為模板，用FAd V-4的檢測引物進行PCR擴增[13]，擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，檢測目的條帶。

1.5 FAdV-4 Hexon和Fiber-2全基因擴增、克隆及測序

以陽性樣品的DNA為模板（陰性對照以無菌去離子水代替DNA模板）進行Hexon和Fiber-2全基因序列擴增。取5μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 FAdV-4 Hexon與Fiber-2基因序列分析

采用DNAStar Version 7.1軟件中的MegAlign程序?qū)y序結果進行比對，并與GenBank中獲得的Ⅰ群FAd V的27個血清型參考序列進行同源性比較，用MEGA 7.0軟件進行遺傳進化分析并且繪制遺傳進化樹。FAdV-4參考序列如表2所示。

1.7 病毒分離培養(yǎng)

將PCR陽性樣品進行處理，取上清液100μL接種LMH細胞，每天觀察細胞病變（CPE），待病毒液形成穩(wěn)定的細胞病變后繼續(xù)傳5代，收集病毒液進行PCR檢測[14]。

1.8 病毒的TCID50測定

將生長良好的LMH細胞消化后，加入96孔板中（100μL/孔）。將病毒液進行10倍梯度稀釋（10-8~10-1）后接種于96孔板中（100μL/孔），每個稀釋梯度8個平行，設正常細胞為對照孔，37℃下置于二氧化碳培養(yǎng)箱中連續(xù)觀察5~7 d，并記錄細胞病變結果[15]，按照Reed-Muench法計算TCID50[16]。

1.9 雞胚致病性試驗

取發(fā)育良好7 d的SPF雞胚7枚，其中，5枚接種F5病毒，接種量為0.2 mL/枚，2枚接種等量無菌生理鹽水作為對照組。用蠟封口后置于37℃孵化箱培養(yǎng)，每隔6 h查看雞胚一次，將24 h內(nèi)死亡的雞胚棄去，120 h后收取雞胚。取雞胚肝臟、心臟、大腦組織進行PCR檢測。

1.10 SPF雞致病性試驗

將7只3周齡的SPF雞隨機分成2組，其中，攻毒組5只，肌肉注射攻毒劑量為105.74TCID50/0.1 mL，0.2 mL/羽；對照組2只，肌肉注射相同劑量的無菌PBS溶液。相同條件下隔離飼養(yǎng)，每12 h觀察一次，連續(xù)觀察15 d，統(tǒng)計雞的發(fā)病和死亡情況。病毒接種后第3、7、14、21、28天采集泄殖腔棉拭子，檢測攻毒雞的排毒情況。剖檢病死雞，觀察剖檢病理變化。采集病死雞的腦、脾臟、腎臟、胸腺、睪丸、腸、肺、法氏囊、胸肌、肝臟和心臟進行FAd V-4的PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 病料樣品的PCR檢測結果

疑似病料樣品用Hexon基因檢測引物進行擴增，電泳結果顯示（圖1），11份樣品在約421 bp處均出現(xiàn)目的條帶，與預期大小一致，初步判斷這11份病料均為FAdV-4陽性樣品。對上述11份陽性病料的基因擴增產(chǎn)物進行電泳，結果顯示，Hexon基因在約2 840 bp處有條帶（圖2），F(xiàn)iber-2基因在約1 440 bp處有條帶（圖3）。

2.2 FAdV-4 Hexon與Fiber-2全基因核苷酸序列的同源性分析

對測序得到的11份樣品中FAdV-4的Hexon和Fiber-2基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)11份樣品FAd V-4的Hexon和Fiber-2基因序列同源性為100%，可認定為同一流行毒株，其序列已上傳至NCBI（序列號：MZ365043，MZ436002）。與Gen Bank中FAd V的參考序列進行同源性比對，結果顯示，Hexon基因與參考株的同源性為67.7%~100%，與基因C型的血清4型參考株同源性最高，為98.4%~100%；與基因A、B、E型參考株的同源性次之，分別為75.3%、74.0%、73.2%~74.1%；與基因D型參考株的同源性最低，僅為67.7%~69.6%。Fiber-2基因與參考株的同源性為43.2%~100%，與基因C型的血清4型參考株同源性為95.9%~100%；與基因A、B、E型參考株的同源性分別為74.7%、74.4%、49.5%~49.9%；與基因D型參考株的同源性最低，為47.8%~49.9%。分析表明，分離毒株為基因C型的血清4型FAd V，命名為SX2020（2020年分離自山西?。?/p>

SX2020株Hexon基因序列與國內(nèi)外4型參考株Hexon基因序列的同源性為98.4%~100%，其中與安徽株、廣東株、山東株、河南株的同源性為100%；與朝鮮株的同源性最高為99.8%；與俄羅斯株的同源性為98.9%；與印度株的同源性最低，為98.4%~98.5%。SX2020株Fiber-2基因序列與國內(nèi)外4型參考株Fiber-2基因序列的同源性為95.9%~100%，其中與安徽株、廣東株、山東濟南株、河南鄭州株的同源性為100%；與印度株同源性最高為98.1%；與墨西哥株的同源性為97.3%；與澳大利亞和加拿大株的同源性最低，為95.9%。

2.3 FAdV-4 Hexon與Fiber-2全基因推導氨基酸序列同源性分析

SX2020株與參考株之間Hexon全基因推導氨基酸序列的同源性為73.2%~99.3%，與基因C型的血清4型參考株的同源性最高，其中與安徽株、廣東株、山東株、河南株的同源性均為99.3%；與印度株同源性最高，為98.8%~99.0%；與俄羅斯株的同源性次之，為98.2%；與朝鮮株的同源性最低，為97.3%~97.4%。SX2020株與參考株之間Fiber-2全基因推導氨基酸序列的同源性為6.0%~99.6%，與基因C型的血清4型參考株的同源性最高，其中與山東株、廣東株、安徽株的同源性均為99.6%；與澳大利亞株、印度株、墨西哥株的同源性為93.7%~97.3%。

通過與國內(nèi)外4型參考毒株Hexon和Fiber-2氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，SX2020株與國內(nèi)參考株氨基酸序列的同源性在99%以上，而與國外參考株相比存在多處氨基酸的替換。

2.4 FAdV-4 Hexon與Fiber-2基因的遺傳進化關系

從FAd V-4 Hexon和Fiber-2基因進化樹可以看出（圖4、5），SX2020株與基因A、B、D、E型參考毒株位于不同分支上，遺傳距離相對較遠；與基因C型的參考毒株均位于同一個分支上；而與4型毒株位于一個小分支上，遺傳距離較近，說明SX2020株屬于基因C型的FAd V-4。另外，SX2020株與國內(nèi)株同源性較近，位于同一個分支上；與國外株距離較遠，同源性遠近關系依次為印度株、俄羅斯株和朝鮮株。

2.5 病毒分離培養(yǎng)結果

將處理的FAdV-4陽性樣品上清液接種LMH細胞，在第1代即可觀察到CPE。隨著傳代次數(shù)的增加，特征性CPE穩(wěn)定出現(xiàn)，LMH細胞變大變圓，部分單個細胞分散，有的4、5個細胞聚成小團，細胞間隙增大，最終致細胞崩解，對照組細胞均無病變。分別取1~5代細胞培養(yǎng)物，提取病毒DNA進行FAdV Hexon基因的PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)，1~5代均擴增出目的基因片段，說明成功培養(yǎng)出FAdV-4病毒。

2.6 病毒TCID50測定結果

將第5代病毒進行10倍連續(xù)稀釋并接種于96孔板，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，記錄細胞病變情況，按照Reed-Muench法計算TCID50，結果顯示，分離毒株病毒滴度為105.74TCID50/0.1 mL。

2.7 雞胚致病性試驗結果

將第5代病毒接種7 d SPF雞胚后，收胚時未發(fā)現(xiàn)死胚，攻毒組感染雞胚后，胚胎體表潮紅，全身有出血點，胚體縮小，剖檢死胚可見肝臟腫大，呈土黃色，質(zhì)脆易碎；對照組雞胚未見異常（圖6）。

提取病雞胚的肝臟、心臟和大腦組織的DNA，用Hexon引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后可見肝臟和心臟出現(xiàn)明顯的特異性目的條帶，與預期片段大?。?21 bp）一致；但在大腦組織中未擴增出目的條帶，說明SX2020病毒可存在于雞胚肝臟與心臟中，但并未通過血腦屏障。

2.8 SPF雞致病性試驗結果

攻毒組SPF雞接種細胞毒后，第3天有2只雛雞表現(xiàn)出食欲不振、精神萎靡、羽毛蓬亂、呼吸困難、排綠色稀糞，其中一只于第6天病死，另一只雛雞逐漸耐過；對照組雛雞無死亡現(xiàn)象。攻毒SPF雞的發(fā)病率為40%（2/5），病死率為50%（1/2）；病死雞剖檢可見心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫脹且有壞死點（圖7）。

對病死雞的腦、脾臟、腎臟、胸腺、睪丸、腸、肺臟、法氏囊、胸肌、肝臟和心臟組織進行PCR檢測，均可擴增出421 bp的目的片段，說明SX2020病毒可廣泛分布于感染雞的各個臟器內(nèi)。

檢測病毒接種后第3、7、14、21天雞的泄殖腔棉拭子，結果顯示，攻毒組雞PCR檢測均為陽性，對照組雞均為陰性；檢測第28天的泄殖腔棉拭子，攻毒組與對照組PCR檢測均為陰性，表明SX2020病毒感染雛雞后排毒時間可持續(xù)21~28 d。

3 結論與討論

禽腺病毒病是近年來影響世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一。FAdV可引起產(chǎn)蛋量下降、包涵體肝炎及心包積液綜合征，其已成為國內(nèi)外研究的焦點。馮敬敬等[17]于2015—2020年從京、津、冀、魯?shù)?0多個省份收集到7 098份FAdV疑似樣品，成功測序Hexon基因1 668份，檢測出了FAd V-1型、FAd V-2型、FAd V-3型、FAd V-4型、FAdV-5型、FAd V-6型、FAd V-7型、FAdV-8a型、FAd V-8b型、FAdV-9型、FAd V-10型和FAd V-11型，其中，F(xiàn)Ad V-4型占比最高，達38.25%，說明FAdV在我國分布廣泛。

由于FAd V的血清型眾多，不同血清型致病性不同。因此，對FAd V血清型鑒定及致病性的研究尤為重要。Hexon蛋白是FAdV的主要結構蛋白，通過對Hexon基因進行測序和遺傳進化比對，可準確區(qū)分不同的血清型，常作為FAdV基因分型的靶基因[18]。本研究分離的SX2020株為基因C型的血清4型FAdV，其Hexon和Fiber-2全基因推導氨基酸序列與國內(nèi)FAd V-4參考株的同源性在99%以上，與國外FAd V-4參考株的同源性為98.4%~98.5%，說明Hexon與Fiber-2蛋白保守性極強。宋玲玲等[19]研究證實，山東株Hexon基因與國內(nèi)參考株Hexon基因序列相同，具有高度保守性。金前躍等[20]研究表明，河南株FAd V-4 ZZ株的Hexon基因與國內(nèi)流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列同源性均為100%，與國外株同源性分別為98.69%和98.90%，即與國內(nèi)株同源性一致，與國外株則存在遺傳變異，此結論與本研究得出的結論一致。RASHID等[21]對廣西9個暴發(fā)FAdV疫情地區(qū)中分離毒進行了全基因組測序，結果表明，分離株與其他最近分離的中國株親緣關系較近，主要結構基因序列與非中國分離株相比有一些缺失和明顯的氨基酸突變。

任士飛等[22]從江蘇某地分離的FAdV-4對3周齡SPF雛雞的致死率為100%，死亡雞可見典型的心包積液與包涵體肝炎癥狀。程增青等[23]從河南分離的FAd V-4毒株感染SPF雞后，于感染后第2天開始發(fā)病，死亡期主要集中在感染后第3~7天，感染后第10天未死亡雞均恢復正常。YIN等[24]從120日齡產(chǎn)蛋雞肝臟樣品中分離出高致病性禽腺病毒（FAdV）毒株AH-F19，可引起3周齡SPF雞全部死亡，并表現(xiàn)出典型的心包積液和肝炎。本研究采用分離培養(yǎng)的SX2020毒株接種7日齡雞胚，可使雞胚發(fā)生病變；接種3周齡SPF雛雞，可使雛雞發(fā)病死亡，發(fā)病率為40%，病死率為50%，說明SX2020毒株具有較強的致病性；病毒接種后第3~21天泄殖腔棉拭子PCR檢測呈陽性，第28天檢測呈陰性，表明SX2020毒株感染雛雞后排毒時間可持續(xù)21~28 d。

本研究對采自山西中部地區(qū)的太谷、祁縣、介休、臨汾、長治、交城、柳林等養(yǎng)雞場的疑似FAd V-4病料進行了PCR檢測，并分離出1株FAd V-4病毒，其Hexon基因序列與國內(nèi)同源性較高可達99%以上；接種SPF雞胚與SPF雞后均表現(xiàn)出一定的致病性；攻毒雞的排毒時間長，可達21~28 d。該研究結果為山西省FAdV-4疫苗的研發(fā)及防控提供了試驗依據(jù)。