?？调噺V椒中乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵特性的評價

張逸舒，王玉榮，陳蕓曼，張傲然，張振東，郭壯

（湖北文理學院食品科學技術(shù)學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053）

?？悼h位于秦巴山區(qū)深處，隸屬湖北省襄陽市，西連神龍架，北交武當山，境內(nèi)山巒重疊森林覆蓋率達66.8%，生活著漢族、畬族、回族和土家族等多個民族[1]。特殊的地理環(huán)境及多民族雜居的現(xiàn)狀賦予了其獨特的飲食文化，?？档貐^(qū)居民歷來有制作和食用鲊廣椒、臭豇豆、臭豆渣和臭醬巴的習俗。?？档貐^(qū)鲊廣椒以鮮紅辣椒和苞谷面（玉米磣）為主要原料，采用厭氧發(fā)酵制作而成，具有酸辣可口和味道鮮香的特點，常作為輔料用于臘肉、雞蛋和魚類的烹飪中。傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風味品質(zhì)與其微生物多樣性息息相關(guān)，而發(fā)酵食品制作地的生態(tài)環(huán)境在很大程度上影響了其蘊含的微生物群系[2]。曾有研究對湖北當陽地區(qū)鲊廣椒的微生物多樣性進行解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鲊廣椒中的細菌主要以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主[3-4]。然而目前關(guān)于?？档貐^(qū)鲊廣椒乳酸菌多樣性研究的報道尚少。

作為現(xiàn)代食品加工業(yè)常用的發(fā)酵劑，乳酸菌廣泛存在于泡菜[5]、發(fā)酵肉制品[6]、發(fā)酵乳制品[7]、發(fā)酵酒[8]和人體腸道[9]中，長期食用乳酸益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群[10]和改善代謝綜合癥[11]的功效。鲊廣椒的發(fā)酵原料為蔬菜和淀粉質(zhì)食材，發(fā)酵方式為厭氧固態(tài)發(fā)酵，制作方法亦與酸奶、泡菜及臘肉制品均存在較大的差異，因而其乳酸菌群系可能存在一定的特殊性，所以在解析乳酸菌多樣性的基礎上開展菌株收集工作具有積極的意義。在實地調(diào)研過程中，本研究團隊發(fā)現(xiàn)鲊廣椒雖然廣泛分布于我國云南、四川、重慶、湖北、湖南和貴州等華中和西南地區(qū)，但其產(chǎn)業(yè)化程度較低，多以百姓自制為主，且制作的鲊廣椒產(chǎn)品風味品質(zhì)相對較差，存在輕微臭味等產(chǎn)品缺陷問題。由此可見，積極開展具有優(yōu)良發(fā)酵特性鲊廣椒來源乳酸菌的篩選，以乳酸菌純種發(fā)酵代替自然發(fā)酵，對鲊廣椒風味品質(zhì)和食用安全性的提升均具有積極意義。

本研究采用純培養(yǎng)和16S rRNA 鑒定技術(shù)對7 份采集自?？档貐^(qū)的鲊廣椒中乳酸菌多樣性進行了解析，在對其乳酸菌分離株進行分離鑒定的基礎上，采用電子鼻和電子舌從風味和滋味兩個維度對具有優(yōu)良發(fā)酵特性的菌株進行篩選，以期對后續(xù)鲊廣椒風味品質(zhì)的提升提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米磣和二荊條紅辣椒：市購；石蕊牛乳培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、碳酸鈣、甘油、草酸銨結(jié)晶紫、碘、95 %乙醇、番紅、過氧化氫、磷酸二氫鉀、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、氯仿、異戊醇、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecy1 trimethylammonium bromide，CTAB）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；10×PCR Buffer、dNTP、Taq酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：西班牙Biowest 公司；27F、1495R 通用引物：武漢天一輝遠有限公司；陰離子溶液、陽離子溶液：日本INSENT 公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸：西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

YL90-2 磨面機：上海捷朗機電有限公司；BS224S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ECLIPSE Ci 生物顯微鏡：日本Nikon 公司；XFS-280 手提式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；DG250 厭氧工作站：英國Don Whitley 公司；vetiri 梯度基因擴增儀：美國AB 公司；UVPCDS8000 凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple 公司；LRH-150 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；PGJ-10-AS 純水儀：武漢品冠儀器設備有限公司；DYY-12 電泳儀：北京六一儀器廠；SA402B 味覺分析系統(tǒng)：日本Insent 公司；PEN3 便攜式電子鼻：德國Airsense 公司；LC-20ADXR 高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

每份鲊廣椒樣品取5 g 于150 mL 石蕊牛乳培養(yǎng)基中 37 ℃增殖培養(yǎng) 24 h 后，選 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66 個梯度進行倍比稀釋，繼而用移液器吸取200 μL各梯度稀釋液分別涂布于含有碳酸鈣的MRS 固體培養(yǎng)基上，并于厭氧工作站中37 ℃培養(yǎng)48 h，厭氧工作站通入體積比為85 ∶10 ∶5 的氮氣、氫氣和二氧化碳混合氣體[12]。挑選平板上有溶解圈且形態(tài)、大小和顏色等均不相同的菌落進行2 次劃線，并將得到的單一菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，選擇革蘭氏陽性和過氧氫酶陰性的菌株定義為疑似乳酸菌菌株，并用甘油管冷凍保藏法保藏后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌基因組DNA 提取、16S rRNA 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增和菌株鑒定

使用CTAB 法進行DNA 提取[13]，提取后的DNA樣品置-20 ℃暫存?zhèn)溆谩Ｒ源薉NA 為模板，利用PCR 擴增其 16S rRNA 基因片斷。PCR 擴增體系（50 μL）的配制：27F 和 1495R 各 1 μL、模板 1 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Taq 酶 0.4 μL，最后加無菌超純水37.6 μL 至 50 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性 4 min，94 ℃變性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min30 s 循環(huán) 30 次，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保溫[12]。

取上述PCR 產(chǎn)物2.5 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳，膠的濃度為1%，電泳后染色觀察，用凝膠成像儀照相。將擴增成功的PCR 產(chǎn)物用PCR 清潔試劑盒清潔，清潔后PCR 產(chǎn)物進行連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后送武漢天一輝遠有限公司測序。序列測序結(jié)束后用DNAMAN 對序列結(jié)果進行拼接及引物序列校準，然后用于同源性比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所得序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行 BLAST（Basic Local Alignment SearchTool）同源性比對，以同源性大于等于99%為分界閾值鑒定待測菌株[14]，將菌株序列提交至GeneBank，獲得登錄號（MH656804-MH656824）。利用 MEGA7 與模式菌株進行系統(tǒng)進化親緣關(guān)系研究并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

此外，人們還會受到氣候、就業(yè)和稅率等因素的影響，那些在城市中沒有比較穩(wěn)定家庭的人往往對這些因素的反應會更為劇烈。選擇住在農(nóng)村和城郊地區(qū)居住的人們發(fā)現(xiàn)農(nóng)村和城郊地區(qū)空氣更清新、環(huán)境更安靜、生活空間更大，有益于自身的身心健康。而且隨著信息化的發(fā)展，較小的城鎮(zhèn)也有方便的購物渠道以及便捷的信息獲取方式。

1.3.3 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒樣品的制備

取750 g 玉米磣、225 g 切碎的二荊條紅辣椒（保留其汁液和水分）、3.15 g 花椒粉、3.15 g 胡椒粉、75 g食鹽混合均勻備用。1.3.2 中分離鑒定的13 株植物乳桿菌使用MRS 液體培養(yǎng)基活化3 代，離心收集菌體，用50 mL 生理鹽水懸浮后，按照5×106/g 原料的比例接入混合均勻的鲊廣椒原料中，同時以不添加乳酸菌的樣品作為對照。將2 L 玻璃泡菜壇壇口擦拭干凈，使用噴壺于壇口噴灑3 mL 白酒，蓋蓋后自來水封口，30 ℃發(fā)酵21 d，樣品備用。

1.3.4 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒風味、滋味和有機酸構(gòu)成的評價

將10 g 鲊廣椒置于樣品瓶中，60 ℃保溫20 min 后室溫25 ℃平衡10 min。參照楊成聰?shù)萚15]的方法，使用PEN3 便攜式電子鼻對其風味品質(zhì)進行評價。

將50 g 鲊廣椒加入150 mL 去離子水浸泡30 min后，12 000 r/min 離心10 min 取上清，上清液置于100 mL量筒中4 ℃過夜，取中間無油脂和殘渣的澄清液體備用。參照王玉榮等[16]的方法，使用SA402B 味覺分析系統(tǒng)對其酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味A、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）的相對強度進行測定。

將 20.00 g 鲊廣椒至 100 mL 容量瓶中，用0.01 mol/L 的磷酸二氫鉀溶液定容后浸泡30 min，浸泡液 12 000 r/min 離心 10 min 取上清液過 0.45 μm 濾膜，濾液備用。參照楊成聰?shù)萚17]的方法，使用高效液相色譜法對其乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸含量進行檢測。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

基于電子鼻和電子舌數(shù)據(jù)矩陣，使用主成分分析（principal component analysis，PCA）對植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒的品質(zhì)進行評價。使用SAS9.0 軟件PCA，使用Origin 2017 軟件繪圖，使用Mega7.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?？档貐^(qū)鲊廣椒中乳酸菌的分離鑒定

本研究共從湖北保康地區(qū)采集以玉米和二荊條辣椒為原料制作的鲊廣椒樣品7 份，采用純培養(yǎng)技術(shù)共分離出20 株疑似乳酸菌，在對其基因組DNA 進行提取的基礎上，以16S rRNA 基因全長序列為靶點進行了PCR 擴增，使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行了檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of PCR amplification products of 16S rDNA

由圖1可知，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，20 條泳道中PCR 擴增產(chǎn)物條帶單一且明顯，長度約在1 500 bp。由此可見，PCR 無非特異性擴增，且擴增產(chǎn)物濃度較高，符合后續(xù)清潔、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定的需要。

將測序反饋回的序列信息進行比對后，與同源性比對結(jié)果≥99%的模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree

由圖2可知，分離出的20 株疑似乳酸菌被鑒定為4 個種，其中菌株HBUAS52326 和HBUAS52338 與模式株Lactobacillus brevis JCM1059 位于1 個分支上，因而鑒定為短乳桿菌（L.brevis）；菌株 HBUAS52335 和HBUAS52334 與模式株 L.alimentarius DSM20249 位于1 個分支上，因而鑒定為食品乳桿菌（L.alimentarius）；菌株HBUAS52341 與模式株L.crustorum R-27957 位于1 個分支上，因而鑒定為面包乳桿菌（L.crustorum）；其他15 株乳酸菌均與模式株L.plantarum JCM1149 位于1 個分支上，因而鑒定為植物乳桿菌（L.plantarum）。由此可見，植物乳桿菌為保康地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌，占分離株總數(shù)的75.0%。值得一提的是，所有菌株與模式株的同源性均為100%，因而本研究的鑒定結(jié)果具有較高的可靠性。

2.2 植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒風味品質(zhì)的評價

在對?？档貐^(qū)鲊廣椒中乳酸菌進行分離鑒定的基礎上，本研究擬進一步評價植物乳桿菌純種發(fā)酵對鲊廣椒品質(zhì)的影響。由于L.plantarum HBUAS52330 和L.plantarum HBUAS52331 在MRS 液體培養(yǎng)基中生長緩慢，因而選取了其他13 株植物乳桿菌進行了鲊廣椒的制備。電子鼻各傳感器對不同處理鲊廣椒響應值的差異性分析如表1所示。

表1 電子鼻各傳感器對不同處理鲊廣椒響應值的差異性分析Table 1 Difference analysis of response value of Zhaguangjiao samples with different treatment by electronic nose

續(xù)表1 電子鼻各傳感器對不同處理鲊廣椒響應值的差異性分析Continue table 1 Difference analysis of response value of Zhaguangjiao samples with different treatment by electronic nose

由表1數(shù)據(jù)可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵的多數(shù)鲊廣椒揮發(fā)性風味物質(zhì)中芳香類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)明顯增多，而氫氧化物、甲烷、乙醇和有機硫化物含量明顯下降。因芳香類物質(zhì)為鲊廣椒特征性風味指標的重要組成部分，而乙醇和有機硫化物為缺陷型指標的組成部分，因而多數(shù)植物乳桿菌進行純種發(fā)酵可明顯提升鲊廣椒的風味品質(zhì)。

2.3 植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒滋味品質(zhì)的評價

在使用電子鼻對植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒風味品質(zhì)進行評價的同時，進一步使用電子舌對其滋味品質(zhì)進行評價。在進行數(shù)據(jù)處理時，將自然發(fā)酵的鲊廣椒各滋味品質(zhì)均設置為0，各植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒樣品減去自然發(fā)酵鲊廣椒各滋味指標的原始強度值即為其相對強度值。植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒各滋味指標相對強度的箱形圖如圖3所示。

圖3 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒各滋味指標相對強度的箱形圖Fig.3 Box plot of response value of Zhaguangjiao samples fermented by L.plantarum with electronic tongue

由圖3可知，鲊廣椒樣品在澀味、酸味和鮮味3 個指標上的差異性較大，其極差值分別為3.36、3.26 和2.88；其次為咸味、苦味和豐度（鮮味的回味），極差值分別為2.10、1.81 和1.00；而在后味B（苦味的回味）和后味A（澀味的回味）2 個指標上的差異較小，極差值僅為0.94 和0.75。由圖3亦可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的鲊廣椒酸味、咸味、鮮味和豐度（鮮味的回味）相對強度明顯高于自然發(fā)酵，而多數(shù)樣品的苦味和澀味呈現(xiàn)出相反的趨勢。

由于酸味和鮮味為鲊廣椒的特征性指標，而苦味和澀味為缺陷型指標，因而采用植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒可明顯提升產(chǎn)品的滋味品質(zhì)。本研究進一步采用高效液相色譜法對鲊廣椒中有機酸的種類和含量進行了分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒各有機酸含量的箱形圖Fig.4 The box plot of content of organic acids in Zhaguangjiao samples fermented by L.plantarum

由圖4可知，乳酸和乙酸為鲊廣椒中的主要有機酸，本研究制備的14 個鲊廣椒樣品中其平均含量分別為2.58 mg/g 和1.44 mg/g；其次為草酸、酒石酸和琥珀酸，平均相對含量分別為1.24、1.05 mg/g 和0.77 mg/g；雖然含有蘋果酸和檸檬酸，但平均相對含量僅為0.39 mg/g 和0.37 mg/g。由圖4亦可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的鲊廣椒中乳酸和酒石酸含量明顯偏高，這可能是導致鲊廣椒樣品酸味升高的主要原因。

2.4 基于PCA植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒品質(zhì)的評價

進一步采用PCA 以電子鼻和電子舌的18 個指標為參數(shù)，采用因子載荷圖對各指標進行了分類，同時采用因子得分圖對不同處理鲊廣椒樣品進行了空間排布。因子載荷圖如圖5所示。

圖5 基于PCA 的PC1 和PC2 因子載荷圖Fig.5 Factor loading diagram of PC1 and PC2 based on PCA

由圖5可知，第一主成分（principal component 1，PC1）與PC2 的貢獻率分別為48.19%和19.96%，在進行PCA 時若主成分貢獻率越大則表示該主成分反映原有多指標的信息越全面[18]。由此可見，僅采用PC1 和PC2 信息即可反映本研究近70%的數(shù)據(jù)信息，因而本研究的分析結(jié)果相對可靠。由圖5亦可知，PC1 主要由W1C、W3C、W5C、W1W、W5S、W2W、W1S 和 W2S 構(gòu)成，且 W1C、W3C、W5C 這 3 個對芳香類物質(zhì)敏感的傳感器均位于X 軸負方向；PC2 主要由酸味、苦味、澀味和后味B（苦味的回味）構(gòu)成，且鲊廣椒的特征性風味物質(zhì)酸味主要位于Y 軸負方向。由此可見，PC1 主要由風味指標構(gòu)成，PC2 主要由滋味指標構(gòu)成，且在因子得分圖中空間排布越偏向左下方的鲊廣椒樣品其品質(zhì)越好。因子得分圖如圖6所示。

圖6 基于PCA 的PC1 和PC2 因子得分圖Fig.6 Factor scores diagram of PC1 and PC2 based on PCA

由圖6可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的多數(shù)鲊廣椒樣品空間排布較之對照組偏向左下方，因而多數(shù)植物乳桿菌進行純種發(fā)酵可明顯提升鲊廣椒的品質(zhì)。較之其他菌株，L.plantarum HBUAS52332 制備的鲊廣椒雖然風味品質(zhì)一般，但其酸味較為濃郁，L.plantarum HBUAS52327 制備的鲊廣椒風味和滋味品質(zhì)均較佳。由此可見，L.plantarum HBUAS52327 和L.plantarum HBUAS52332 可進一步用于后續(xù)具有優(yōu)良鲊廣椒發(fā)酵特性菌株的篩選。

3 結(jié)論

植物乳桿菌為?？档貐^(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌，多數(shù)植物乳桿菌菌株進行純種發(fā)酵可明顯提升鲊廣椒的風味和滋味品質(zhì)。乳酸和乙酸為鲊廣椒中的主要有機酸，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的鲊廣椒中乳酸和酒石酸含量明顯偏高。L.plantarum HBUAS52327 和L.plantarum HBUAS52332 純種發(fā)酵制備的鲊廣椒樣品具有較好的品質(zhì)，可進一步用于后續(xù)具有優(yōu)良鲊廣椒發(fā)酵特性乳酸菌菌株的篩選。