雙參通脈顆粒對大鼠心肌缺血NF-κBp65蛋白表達的影響

心肌短時間缺血致其無法得到充足的營養(yǎng)，再通后會造成心肌一定程度損傷，稱為急性心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI常伴炎癥反應，血中炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等大量釋放，介導心肌氧化損傷，使損傷惡化加重。NF-κBp65是細胞核內重要的轉錄調節(jié)因子，在炎癥因子的刺激下，NF-κBp65通常依賴經(jīng)典信號途徑被活化，介導細胞凋亡。本實驗采用左冠狀動脈結扎法復制大鼠心肌缺血模型，觀察雙參通脈顆粒對心功能的保護作用，探討其對炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及心肌組織NF-κBp65蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 雙參通脈顆粒(ginseng and salvia granules for promoting blood flow，GSG)為遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內制劑，合心爽(鹽酸地爾硫卓片，diltiazem hydrochloride，DH)購自天津田邊制藥有限公司，IL-1β檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒購自凱基生物有限公司，NF-κBp65抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 實驗儀器 5234R型高速離心機(德國Eppdendorf公司)，BB23型培養(yǎng)箱(美國PE公司)，ROTEAN電泳系統(tǒng)(美國Bio公司)，冰凍切片機OM3123型(瑞典Bio公司)，恒溫恒濕箱(上?？萍忌锕?，Leica圖像分析儀(德國Leica公司)。

1.3 心肌缺血模型的復制 SD大鼠40只，2.5%戊巴比妥腹腔內注射麻醉，成功后，取大鼠仰臥位固定于手術臺上，氣管切開插管，小動物呼吸機輔助呼吸，調節(jié)參數(shù)：頻率85次/min、潮氣量18 mL、呼吸比1∶1，于術中記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖。頸部、心前區(qū)剪毛，碘伏消毒術野，心前區(qū)胸骨左側第3肋間切口，逐層鈍性分離皮下組織，沿肋間剪開肌肉，分離肋骨，暴露心包，大鼠呼氣末破入胸膜，進入心包，小心剪開心包膜，暴露心臟，左右各上一眼科用小拉鉤使心臟暴露充分，找到左心耳，于肺動脈圓錐與左心耳交界處下方確定結扎位置，以6-0號帶線縫合針在冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)下方2 mm處結扎，進針深度約2 mm，心電圖(ECG)監(jiān)測到ST段抬高0.2 mV即為造模成功，持續(xù)30 min后打開結扎線，再灌注120 min，胸腔放置引流管，逐層縫合肋骨、肌肉，關閉胸腔，抽出胸腔積氣積液，拔出引流管。

1.4 實驗動物分組與給藥 健康成年SD大鼠，體重280～300 g，隨機分為4組，每組10只。假手術組(sham operation group，Sham組)只開胸不結扎，生理鹽水灌胃，1次/日，連續(xù)4周；模型組(MIRI組)開胸結扎LAD 30 min，再灌注120 min，生理鹽水灌胃，1次/日，連續(xù)4周；合心爽治療組(DH組)：開胸結扎LAD 30 min，再灌注120 min，合心爽灌胃，4.23 mg/kg，1次/日，連續(xù)4周；雙參通脈顆粒治療組(GSG組)開胸結扎LAD 30 min，再灌注120 min，雙參通脈顆粒灌胃，按大鼠體表面積給藥，相當于生藥量11 g/kg，1次/日，連續(xù)4周。

1.5 血流動力學測定 取材前，分離右側頸總動脈，左心導管插管至左心室，由 ALC-MPA 多導生物信號分析系統(tǒng)記錄血流動力學參數(shù)，包括左室收縮壓(LVSP)、左室舒張壓(LVDP)、心率(HR)。

1.6 取材方法 經(jīng)腹主動脈負壓采血2～10 mL，低溫離心，試管編號后，留存?zhèn)溆?；取左室中部連續(xù)2塊厚2～3 mm 心肌組織，浸泡于4%多聚甲醛中，病理學觀察；剩余缺血區(qū)心肌組織置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.7 實驗前后大鼠心率變化測定 將大鼠麻醉后仰臥固定于實驗臺上，按照右上肢紅色，右下肢黑色，左上肢黃色，左下肢綠色的順序，將肢導聯(lián)的電極針插入動物四肢的皮下(注意不要插入四肢肌肉)，連接好導聯(lián)線至心電圖機，即可進行心電圖的記錄。全程記錄各組大鼠一般狀態(tài)及心率變化，并判定造模是否成功。

1.8 心肌組織病理變化觀察 組織標本固定于4%多聚甲醛中，觀察時各級乙醇脫水，石蠟固定，進行常規(guī)切片，再于二甲苯、各級乙醇中脫水，蘇木精-伊紅(HE)染色，二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察左心室組織學改變。

1.9 血清IL-1β、IL-6、TNF-α測定 經(jīng)腹主動脈負壓采血 2～10 mL，3 000 r/min離心取血清，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按試劑盒說明書進行。

1.10 心肌組織NF-κBp65蛋白表達 提取總蛋白，加液氮研磨，加RIPA裂解液，漩渦混勻，放置 1 h ，4 ℃，13 000 r/min離心 20 min，檢測蛋白濃度，計算所需蛋白上樣量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，電壓100 V，恒壓轉膜90 min，轉移到硝酸纖維膜上。轉膜完成后，牛奶封閉1 h，PBST溶液洗膜3次，每次7 min，加入一抗，孵育4 h，PBST 洗膜 3次，每次7 min。加入溶有鼠或兔二抗的牛奶，室溫孵育 1 h，PBST 洗膜3次，每次10 min，加顯色液顯色，暗室中顯影。ImageJ軟件進行western蛋白定量分析。

2 結 果

2.1 血流動力學(見表1)

組別只數(shù)LVSP(mmHg)LVDP(mmHg)HR(次/min)Sham組10124.84±6.14 6.34±1.4821.63±5.32 MIRI組1096.32±6.191)14.16±2.041)40.07±7.981)DH組 10110.36±4.012)10.78±1.372)19.08±4.312)GSG組10130.57±1.082)3)7.16±1.972)3)13.25±3.642)3)F值5.6482.3493.241P<0.01<0.01<0.01

注：1 mmHg=0.133 kPa。與Sham組比較，1)P<0.05；與MIRI組比較，2)P<0.05；與DH組比較，3)P<0.05

2.2 造模前后大鼠心電圖變化(見圖1)

A為術前；B為術后

2.3 各組大鼠心肌病理變化 Sham組：心肌細胞排列緊密、規(guī)整、間隙小，未發(fā)現(xiàn)有明顯水腫區(qū)域存在，肌纖維無明顯扭曲。心肌細胞膜完整、界限清晰、細胞核位置居中，細胞間隙無紅細胞出現(xiàn)，炎癥浸潤。MIRI組：肌纖維扭曲紊亂，亦有部分纖維斷裂；細胞腫脹變大，組織間隙增寬，水腫現(xiàn)象明顯，炎細胞浸潤布滿視野；細胞間隙可見大量紅細胞存在，出血情況嚴重；細胞核散亂無規(guī)律。DH組：炎細胞浸潤明顯，紅細胞滲出較多，然而細胞間的水腫情況有所好轉，肌纖維斷裂現(xiàn)象較少。GSG組：與MIRI組比較損傷顯著降低，顯微鏡下觀察時細胞邊界清晰、輪廓完整，組織間隙仍有不同程度水腫，但整體較輕，紅細胞滲出不多。詳見圖2。

圖2 心肌組織病理改變(HE染色，×200)

2.4 血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量變化(見表2)

組別只數(shù)IL-1βIL-6TNF-α(×103)Sham組10184.35±4.64124.03±6.101.53±0.25MIRI組10286.52±6.191)164.37±1.361)1.94±0.361)DH組 10195.21±3.122)139.15±4.132)1.26±0.122)GSG組10164.27±1.052)3)104.13±4.652)3)1.01±0.142)3)F值6.3142.2472.014P<0.01<0.01<0.01

與Sham組比較，1)P<0.05；與MIRI組比較，2)P<0.05；與DH組比較，3)P<0.05

2.5 心肌組織NF-κBp65蛋白表達 與Sham組(0.92±0.06)比較，MIRI組(1.63±0.07)NF-κBp65蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與MIRI組比較，DH組(1.53±0.13)NF-κBp65蛋白表達明顯下降(P<0.05)；與DH組比較，GSG組(1.13±0.37)NF-κBp65蛋白表達明顯下降(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 心肌組織NF-κBp65蛋白表達變化

3 討 論

在心肌缺血再灌注損傷病理過程中，炎性介質介導的炎癥反應起到了至關重要的作用，中性粒細胞釋放炎癥物質，誘導細胞黏附分子表達，促使粒細胞進入缺血區(qū)，加重氧化損傷[1-2]。心肌缺血氧化損傷可促進氧自由基的產(chǎn)生,刺激組織釋放炎性介質，如IL-1β、IL-6、TNF-α等[3]，引發(fā)NF-κB信號轉導通路的激活，放大炎癥信號，組織中NF-κBp65蛋白表達增加。MIRI是系統(tǒng)炎癥與局部炎癥共同作用的結果[4-7]。NF-κB是一種具有調控細胞因子、化學因子功能的核轉錄因子，其對炎癥反應、免疫應答及細胞凋亡均有調節(jié)作用，是參與MIRI細胞氧化損傷的主要作用靶點[8]。NF-κB的異常激活與心肌細胞凋亡密切相關。

GSG由中藥人參、丹參、黃芪、麥冬、川芎、當歸6味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡的功效。人參，五加科植物人參的干燥根，味甘苦、性平，歸肺、脾、心經(jīng)，具有大補元氣、補脾益肺、生津安神等功效?，F(xiàn)代藥理研究證實人參皂苷對大鼠腹主動脈縮窄所致的心肌肥厚有抑制作用，其機制可能與干預NF-κB信號轉導通路有關[9]。丹參，唇形科植物鼠尾草丹參的干燥根及根莖，具有活血調經(jīng)、涼血消癰等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明丹參具有抗血小板聚集、降低血液黏度、調節(jié)凝血系統(tǒng)的功能，是一種安全可靠的治療心血管疾病的天然中藥[10]。黃芪，豆科多年生草本植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的根，味甘，性微溫，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒生肌的功效。黃芪皂苷可通過抑制心肌細胞膜Na+-K+-ATP酶增強心肌收縮力，改善心室構型和射血功能，改善心肌營養(yǎng)，降低心肌耗氧量，并可穩(wěn)定細胞膜，從而減輕心肌細胞損傷[11]。麥冬，百合科植物麥冬的干燥塊根，味甘、微苦，微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。麥冬總皂苷對心肌細胞缺氧再灌注損傷具有保護作用[12]。川芎，傘形科藁本屬川芎的根莖，性溫味辛，歸肝膽經(jīng)，為血中氣藥，行氣活血，開郁止痛。川芎嗪可以通過抑制NF-κB信號通路，來改善由血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)介導的新生小鼠心肌細胞肥大[13]。當歸，傘形科植物當歸的根，性溫味甘辛，歸心肝脾經(jīng)，具有補血和血、調經(jīng)止痛、潤燥滑腸的功效。當歸提取液高劑量(80 mg/kg)條件下對血栓的形成有拮抗作用，阿魏酸及多種氨基酸具有抗心律失常、擴張血管、減少細胞凋亡等多種藥理作用[14]。

本實驗證實GSG組IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯減少，表明GSG能有效降低心肌IL-1β、IL-6、TNF-α濃度，減輕炎癥反應，減輕心肌缺血再灌注損傷。GSG組心肌組織NF-κBp65蛋白表達明顯降低，表明GSG可能通過調節(jié)NF-κB抑制心肌細胞凋亡。細胞凋亡是MIRI的重要損傷因素，本實驗表明GSG能減輕心肌炎癥反應，降低心肌細胞凋亡，減輕氧化損傷，其機制可能與降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性介質，抑制NF-κBp65蛋白表達有關。