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      食源性致病微生物阪崎腸桿菌核酸檢測試劑盒的研究

      2019-08-27 09:19:34萬宇平馬玉華賈芳芳王琳琛北京勤邦生物技術(shù)有限公司北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心
      食品安全導(dǎo)刊 2019年22期
      關(guān)鍵詞:阪崎食源性國標(biāo)

      □ 萬宇平 馬玉華 賈芳芳 王琳琛 北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心

      食品安全問題一直是社會各界關(guān)注的重點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織曾報(bào)道稱,食源性疾病是受全球關(guān)注的衛(wèi)生問題,更是影響人類健康的重要因素,而病原微生物感染則是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的主要因素。阪崎腸桿菌在2002年被國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICMSF)確定為食源性致病菌,如被阪崎腸桿菌感染可能會引起嬰幼兒尤其是新生兒患病,如腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等,更有甚者會引起嚴(yán)重的后遺癥或死亡。有數(shù)據(jù)顯示,目前只有嬰幼兒奶粉與這一疾病的爆發(fā)相關(guān)。

      傳統(tǒng)的致病微生物檢測方法有國標(biāo)法和紙片法,但因操作復(fù)雜且測試周期過長,其已經(jīng)無法跟上經(jīng)濟(jì)發(fā)展的步伐,不能滿足我國快速發(fā)展的食品行業(yè)對食品檢測工作的需求。因此,建立一種在嬰幼兒奶粉中快速、高效、靈敏的檢測阪崎腸桿菌的方法至關(guān)重要。

      本研究是一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)而開發(fā)的快速檢測食品中阪崎腸桿菌的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop Mediated Isothermal Amplification,以下簡稱“LAMP法”)是日本榮研株式會社研究發(fā)明的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法,其利用4個特殊的引物特異識別靶基因的6個特定區(qū)域,采用具有強(qiáng)鏈置換活性的BstDNA聚合酶,實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下的體外擴(kuò)增。本研究根據(jù)阪崎腸桿菌的16-23S基因設(shè)計(jì)了6條引物,并將其與目的基因的6個區(qū)域相結(jié)合,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本試劑盒能在60min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng),且技術(shù)要求低,具有快速、簡便等優(yōu)點(diǎn),能有效解決傳統(tǒng)檢測方法耗時(shí)長、結(jié)果可靠性差等問題,適合各級實(shí)驗(yàn)室及基層單位推廣使用。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      引物、DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、Buffer緩沖液、顯色劑、DNA提取液。

      PCR擴(kuò)增儀。

      1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系

      1.2.1 制備環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系

      6條引物分別如下:內(nèi)引物1為5' -TAGCCAACCGATGTTTCTGTATCAAACAATACTACAAAGGTGCTTTCG-3'(SEQ ID No.1); 內(nèi) 引 物2為5'-AGAAGTCATTAGCGAACAGGCTACGCGTAAGATTCTTGCTCAGTAG -3'(SEQ ID No.2); 外 引 物1為5'-GTGAGAACGGGACCATCA -3'(SEQ ID No.3);外引物2為5'- CTTGTTTTTGTAGGGTTTGGA-3'(SEQ ID No.4); 環(huán) 引 物 1 為5'-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG- 3'(SEQ ID No.5); 環(huán) 引 物2為 5'-GATTAGCACGTCCTTCATCG- 3'(SEQ ID No.6)。

      DNA聚合酶:Bst DNA聚合酶,濃度為 8U/μL;dNTP:濃度為 25mM;MgSO4: 濃 度 為 50mM;Buあer緩 沖液:10×buあer;顯色劑:熒光染料1000×SYBR Green I;DNA提取液。

      1.2.2 鑒定阪崎腸桿菌與非阪崎腸桿菌

      本實(shí)驗(yàn)所述待檢樣品為添加阪崎腸桿菌的奶粉樣本。

      模板DNA提?。簩?mL的樣本置于1.5mL離心管;12000r/min離心2min,棄上清;然后加入DNA提取液80μL,煮沸10min;最后離心取上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中作為模板DNA。

      環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng):在200μL PCR管配制反應(yīng)體系,外引物終濃度為0.2μM,內(nèi)引物、環(huán)引物終濃度為0.6μM,1×buあer反應(yīng)緩沖液,3mM MgSO4,0.5mM dNTP,8U Bst DNA聚合酶,樣本模板2.5μL,超純水補(bǔ)足25μL,然后加入30μL的密封液,將上述反應(yīng)管于65℃反應(yīng)60min。

      結(jié)果判定:在上述反應(yīng)管中加入1μL 1000×SYBR Green I,混勻后觀察反應(yīng)液的顏色,若呈現(xiàn)綠色則為阪崎腸桿菌,橙色則為非阪崎腸桿菌。

      檢測結(jié)果:PCR管呈現(xiàn)綠色,表明待檢樣品所感染的致病菌為阪崎腸桿菌。

      1.3 特異性與靈敏度

      1.3.1 檢測材料及方法

      互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)平臺符合摩爾定律,微處理器的性能每隔18-24個月提高一倍,而價(jià)格下降一半。10年半左右可以提升128倍量級,128倍量級必然帶來內(nèi)容平臺的巨大變化,互聯(lián)網(wǎng)必然在10年的周期中發(fā)生前所未有的變化。這就決定了融媒體中心建設(shè)需要強(qiáng)化技術(shù)運(yùn)行機(jī)制,當(dāng)自身?xiàng)l件不具備時(shí),積極引入外部支撐力量,快速發(fā)展。

      菌株:金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌CMCC(B) 54002、副溶血性弧菌 ATCC 17802、福氏志賀氏菌CMCC(B)51572、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、阪崎腸桿菌CMCC 45410、陰溝腸桿菌CMCC45301、赫氏艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌O157 H7 ATCC 43888、大腸埃希氏菌25922、威氏李斯特CICC21672、綿羊李斯特CICC21633、格氏李斯特CICC21670。

      食品樣本:幼兒配方奶粉、米粉、營養(yǎng)快線、奶片、鈣奶餅干。

      檢測方法:對各個樣本的檢測嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作,同時(shí)與國標(biāo)方法GB 4789.40-2010進(jìn)行對比。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 特異性

      對常見食源性致病菌菌株及同源性高的菌株提取基因組DNA(按說明書制備基因組DNA),采用核酸檢測試劑盒進(jìn)行單一和交叉污染檢測,每個樣品均進(jìn)行2次重復(fù)檢測,并同時(shí)設(shè)立檢測試劑盒的陰性和陽性對照。(見表1)

      結(jié)果顯示,僅含阪崎腸桿菌的樣品顯示陽性結(jié)果,其余樣品均為陰性,表明該試劑盒具有高度特異性。

      2.2 靈敏度

      純菌靈敏度(CFU/mL):取計(jì)數(shù)后菌液進(jìn)行梯度稀釋(100μL菌液+900μL超純水),按說明書提取DNA模板。取不同濃度梯度測試,每個梯度作兩個平行。

      實(shí)際樣本靈敏度[CFU/25g(mL)]:取計(jì)數(shù)后菌液進(jìn)行梯度稀釋(100μL菌液+900μL超純水),分別取約≥10CFU、<10CFU稀釋液進(jìn)行樣本添加,置于均質(zhì)袋內(nèi),按國標(biāo)方式培養(yǎng)后,取200μL培養(yǎng)液上清提取模板檢測。

      表1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      結(jié)果顯示:純菌靈敏度數(shù)量級為102,但大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),由于模板提取、稀釋誤差等原因,靈敏度數(shù)量級可能為103。因此,純菌靈敏度約為102~103CFU/mL。

      2.2.2 實(shí)際樣本靈敏度(見表3)

      結(jié)果顯示,實(shí)際樣本的靈敏度均可達(dá)到≤10CFU/25g,個別樣本靈敏度試劑盒方法高于國標(biāo)方法。

      表2 純菌靈敏度的測定

      2.3 批間、批內(nèi)差(“+”為陽性、“-”為陰性)

      以嬰幼兒配方奶粉為樣本,進(jìn)行不同量的陽性菌添加(無添加、≥10CFU、<10CFU)并制備成不同濃度的樣品,每個樣品作3個平行,3次重復(fù),測試3批檢測試劑,同時(shí)設(shè)立陰陽對照組。(見表4)

      根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按照公式計(jì)算,試劑盒的批內(nèi)差為0%,批間差為0%,說明試劑盒穩(wěn)定性較好。

      2.4 國標(biāo)符合率

      以嬰幼兒配方奶粉、奶片、營養(yǎng)快線、鈣奶餅干、米粉為樣本,使用不同濃度陽性菌進(jìn)行樣本添加,采用核酸檢測試劑盒與國標(biāo)方法同時(shí)進(jìn)行檢測,比較兩種方法的檢測結(jié)果,每個檢測樣本進(jìn)行3個重復(fù)檢測,同時(shí)設(shè)立試劑盒的陰性對照和陽性對照。(見表5)

      結(jié)果顯示,不同樣本的檢測結(jié)果與國標(biāo)一致。因此,試劑盒檢測方法與國標(biāo)檢測方法的符合率為100%。

      3 驗(yàn)證評價(jià)

      驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,北京勤邦生物技術(shù)有限公司研發(fā)的阪崎腸桿菌核酸檢測方法簡單、快捷,不需要大型儀器設(shè)備;純菌檢測靈敏度為102~103CFU/mL,實(shí)際樣本靈敏度均可達(dá)到≤10CFU/25g,試劑盒具有較高特異性,產(chǎn)品批內(nèi)及批間無明顯差異,實(shí)際樣本檢測國標(biāo)符合率為100%。

      表3 實(shí)際樣本靈敏度的測定

      表4 批間、批內(nèi)差的測定

      表5 阪崎腸桿菌核酸檢測試劑盒與國標(biāo)方法檢測結(jié)果

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