羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥的防控途徑探索

肖俊軍

摘 要 嗜水氣單胞菌是一種人體和動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的致病菌類型，細(xì)菌感染后會(huì)誘發(fā)腹瀉、敗血癥等問(wèn)題，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥是一種嗜水氣單胞菌感染所致的常見(jiàn)魚(yú)體疾病，會(huì)導(dǎo)致病魚(yú)大量死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大影響。因此，將從羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥的發(fā)生原因、診斷以及細(xì)菌培養(yǎng)情況等方面出發(fā)，對(duì)其綜合防控措施進(jìn)行論述分析。

關(guān)鍵詞 羅非魚(yú);細(xì)菌性敗血癥;嗜水氣單胞菌

中圖分類號(hào)：S943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.12.074

細(xì)菌性敗血癥是一種羅非魚(yú)細(xì)菌感染常見(jiàn)疾病，也是導(dǎo)致魚(yú)類大量死亡的主要原因，主要致病菌類型為嗜水氣單胞菌。該種類型細(xì)菌具有較高的溶血性，且會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞毒性、腸毒素和外毒素。疾病常見(jiàn)特征為羅非魚(yú)肛門(mén)紅腫、鰭基出血及體表出血等。羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥具有死亡率高、發(fā)病突然等特征，是為害魚(yú)類健康最嚴(yán)重、經(jīng)濟(jì)損失最大、流行時(shí)間最長(zhǎng)、流行范圍最廣、影響面積最大以及種類最多的傳染病類型。

1 疾病發(fā)生的原因

1.1 魚(yú)體抗病力差

天氣變化、高溫季節(jié)等自然環(huán)境的改變，投喂霉變飼料、營(yíng)養(yǎng)供給不良，頻繁施藥或是過(guò)量用藥，養(yǎng)殖水體的大量換水與加水，以上原因都會(huì)降低羅非魚(yú)的抗病能力，強(qiáng)化應(yīng)激反應(yīng)。一旦水中出現(xiàn)致病菌，則會(huì)最終誘發(fā)羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥問(wèn)題[1]。

1.2 水質(zhì)惡化

池塘養(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)因?yàn)槭┓驶蚴峭娥D過(guò)量而降低養(yǎng)殖水體的營(yíng)養(yǎng)成分含量。高溫季節(jié)養(yǎng)殖過(guò)程中，如果大量施肥或是投放魚(yú)餌，則會(huì)降低水體的溶氧能力，增加亞硝酸鹽、氨氮等有害物質(zhì)，影響水體的正常循環(huán)，最終誘發(fā)細(xì)菌感染。

1.3 發(fā)病季節(jié)

每年的3—11月是羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥發(fā)生率較高的季節(jié)，其中5—9月為發(fā)病高峰期，10月后疫情會(huì)有所改善，發(fā)病率最高的水溫為25～32 ℃[2]。

2 疾病診斷

2.1 初步診斷

羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥的主要特征表現(xiàn)為魚(yú)群大量聚集在池塘出水口緩緩游動(dòng)、食欲不振、魚(yú)體色發(fā)黑等。其中，眼眶、背部、鰓蓋、腹鰭和胸鰭等部位均會(huì)出現(xiàn)上述癥狀。魚(yú)體發(fā)病后，可見(jiàn)肛門(mén)紅腫和體表粘液增多等特征。鏡檢證實(shí)病魚(yú)體表黏液、鰓等患病部位無(wú)寄生蟲(chóng)，魚(yú)體解剖可見(jiàn)腹腔內(nèi)出現(xiàn)大量腹水，鰓蓋內(nèi)緣出血，且腸腔、腸道內(nèi)無(wú)食物。病魚(yú)肝臟可見(jiàn)暗紅色或是土黃色，部分病魚(yú)腹部或是肝臟部位可見(jiàn)病灶出血癥狀。養(yǎng)殖水體理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)：pH值為7.4、亞硝酸鹽偏高、氨氮偏高、水溫26.8 ℃[3]。

2.2 實(shí)驗(yàn)室分離、純化與鑒定

使用70%濃度的酒精消毒病魚(yú)胸腹部，隨后使用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行3次洗滌;由肛門(mén)處打開(kāi)一個(gè)切口，從腹部左側(cè)和右側(cè)分別向上剪去胸腹壁，保證魚(yú)體內(nèi)的臟器充分暴露;再使用70%濃度的酒精消毒魚(yú)體臟器，使用無(wú)菌水進(jìn)行徹底沖洗;通過(guò)灼燒后冷卻的接種環(huán)，由肝、脾和腎等部位分別蘸取組織，再分別接種至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上;將培養(yǎng)基置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)，以30 ℃的溫度進(jìn)行24 h培養(yǎng)。結(jié)果證實(shí)，魚(yú)體肝、脾、腎等部位均出現(xiàn)菌落，且菌落特征表現(xiàn)為淡黃色或無(wú)色的圓整、光滑以及微凸形態(tài)，且伴有芳香的氣味。使用濕潤(rùn)、圓形以及中等大小的單個(gè)菌落，分別進(jìn)行2～3次分離培養(yǎng)。純化處理后的菌株置于30%的甘油中，并在-70 ℃冰箱中保存，待后續(xù)鑒定。菌落大小因培養(yǎng)時(shí)間溫度而異，直徑過(guò)大的菌落不會(huì)產(chǎn)生色素[4]。

通過(guò)梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)實(shí)施病原菌鑒定。結(jié)果證實(shí)，嗜水氣單胞菌是最主要的病原菌類型，其pH值為6～11，7.27為最適宜的pH值環(huán)境。嗜水氣單胞菌適應(yīng)的水溫范圍在14～40 ℃，最適宜的溫度是28～30 ℃，因而夏秋季節(jié)的嗜水氣單胞菌繁殖率最高，通常每15～20 min為一個(gè)繁殖周期。嗜水氣單胞菌屬于一種條件致病菌，通?？稍陴B(yǎng)殖環(huán)境中廣泛分布。若魚(yú)體的養(yǎng)殖環(huán)境理化條件改變或是生理狀態(tài)改變，則會(huì)誘發(fā)嗜水氣單胞菌感染類疾病。嗜水氣單胞菌能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的外毒素作用，進(jìn)入魚(yú)體后會(huì)在腸道內(nèi)增殖，并由門(mén)動(dòng)脈進(jìn)入腎臟、肝臟等組織，最終誘發(fā)血液系統(tǒng)疾病或是肝臟、腎臟等器官疾病[5]。

3 細(xì)菌培養(yǎng)

通過(guò)平板稀釋培養(yǎng)法進(jìn)行嗜水氣單胞菌篩選培養(yǎng)，選擇適當(dāng)顏色、透明度、光澤、表面結(jié)構(gòu)、邊緣形狀、形狀和大小的微生物菌落，挑選后編號(hào)。將所選菌落置于PDA培養(yǎng)基上，并在28 ℃條件下培養(yǎng)4天。以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，通過(guò)抑菌圈法進(jìn)行嗜水氣單胞菌抑菌菌株的培養(yǎng)和保存。從拮抗菌株的培養(yǎng)特征來(lái)看，它具有最強(qiáng)的拮抗性，在蔗糖察氏、燕麥、無(wú)機(jī)淀粉、馬鈴薯以及葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基中接種，并保存在28 ℃環(huán)境下進(jìn)行3～7 d培養(yǎng)。從結(jié)構(gòu)可知在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及色素。使用纖維素水解、明膠液化、碳源利用、淀粉水解和H2S產(chǎn)生等試驗(yàn)進(jìn)行生理生化特征的鑒定。將菌株LFJK-11接種在LB培養(yǎng)基中，連續(xù)連續(xù)12～18 h的震蕩培養(yǎng)，提取基因組DNA，并以DNA組為模板，對(duì)16SrDNA基因擴(kuò)增通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理，結(jié)構(gòu)可見(jiàn)16SrDNA。其中，引物序列為27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，用DNA膠回收試劑盒純化，然后直接寄至上海生工測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析，篩選出9株菌株16SrDNA的全序列，使用ClustalW軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

拮抗檢測(cè)篩選可見(jiàn)1株對(duì)嗜水氣單胞菌HCLF-2具有一定拮抗作用的菌株，編號(hào)為L(zhǎng)FJK-11，抑菌圈直徑為15.6 mm[6]。如表1所示，LFJK-11菌株的拮抗作用對(duì)于大腸桿菌、黑霉菌、金黃色葡萄球菌以及蘇云金桿菌的效果均較為理想，且其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，而對(duì)黑霉菌的抑制作用相對(duì)較差。發(fā)酵液稀釋30～60倍，它的拮抗作用仍然較為顯著，說(shuō)明該菌株的發(fā)酵性能良好[7]。通過(guò)劃線法分別在菌株上接種蔗糖察氏、燕麥、無(wú)機(jī)淀粉、馬鈴薯和葡萄糖酵母膏，并在28 ℃環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)7天。結(jié)果證實(shí)，葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基上的菌株生長(zhǎng)最好，生長(zhǎng)速度較快，菌落較大，邊緣呈放線狀向外擴(kuò)散，表面干燥有突起，孢子呈圓形，具有土腥味。

4 防控措施

4.1 預(yù)防措施

1）徹底清洗和消毒魚(yú)塘。將魚(yú)塘內(nèi)的淤泥徹底清除，是預(yù)防羅非魚(yú)細(xì)菌性敗血癥的最有效措施。具體地，可在冬季徹底清理魚(yú)塘后，噴灑漂白粉或是生石灰進(jìn)行消毒，調(diào)節(jié)水體環(huán)境。2）水體消毒。在魚(yú)塘內(nèi)噴灑生石灰，劑量為20～30 g·m-3，以改善水質(zhì)環(huán)境，調(diào)節(jié)水體的含氨氮量[8]。3）內(nèi)服預(yù)防。高溫季節(jié)在每100 kg飼料中加入30 g維生素E和50 g穩(wěn)定性維生素C，以增強(qiáng)羅非魚(yú)的抗病能力。4）日常飼養(yǎng)。養(yǎng)殖戶應(yīng)掌握科學(xué)養(yǎng)殖的措施，避免投喂變質(zhì)的飼料，保證魚(yú)體自身的抗病能力。5）注射疫苗。魚(yú)種養(yǎng)殖前可浸泡或注射嗜水氣單胞菌疫苗，并保證用法正確[9]。

4.2 治療措施

1）全面噴灑6.6%以上的二氧化氯，劑量為0.20～0.29 g·m-3。若病情較為嚴(yán)重，可每2天使用1次，也可連續(xù)3～5 d投喂0.10～0.15 g·kg-1魚(yú)的氟苯尼考粉，若病情嚴(yán)重可延長(zhǎng)用藥周期。2）全面潑灑50～100 mg·m-3的苯扎溴銨，連續(xù)使用2次，也可內(nèi)服0.1 g·kg-1魚(yú)的磺胺藥[10]。

5 結(jié)語(yǔ)

導(dǎo)致羅非魚(yú)發(fā)生細(xì)菌性敗血癥的原因包括環(huán)境因素、季節(jié)因素以及魚(yú)體自身因素等，因而需要從魚(yú)苗選擇、環(huán)境改善和細(xì)菌監(jiān)測(cè)方面著手進(jìn)行綜合防治，采取全面的防控措施，降低細(xì)羅非魚(yú)菌性敗血癥的發(fā)生率。

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（責(zé)任編輯：趙中正）