錳污染土壤石灰改良對(duì)油茶生長(zhǎng)及抗氧化酶系統(tǒng)的影響

于方明，漆培藝 ，劉可慧，周振明，陳朝述，唐舒婷，李 藝 *

（1.珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西 桂林 541004；3.巖溶生態(tài)與環(huán)境變化研究廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；4.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

錳是植物和人體正常生長(zhǎng)發(fā)育的必需微量元素之一，也是植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）的重要組成成分，在維持葉綠體正常的結(jié)構(gòu)過程中起著重要的作用[1-2]。同時(shí)植物光合作用中電子傳遞系統(tǒng)的氧化還原過程也需要錳的參與[3]。但過量的錳會(huì)抑制植物葉綠素的合成[4]，打破植物體內(nèi)清除機(jī)制的平衡，導(dǎo)致葉片中產(chǎn)生大量的丙二醛（MDA），造成膜脂過氧化和膜脂脫脂反應(yīng)[5]。油茶是世界四大木本油料之一，具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高和生態(tài)功能強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國(guó)特有優(yōu)良木本油料樹種。在廣西，油茶是一種傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)樹種，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，油茶種植面積已超過30萬hm2，已成為廣西重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)資源。有研究表明，在礦山生長(zhǎng)的油茶葉片中的錳含量達(dá)到了2 191.7±213.1 mg·kg-1，是一種潛在的錳污染土壤修復(fù)物種[6]。

無機(jī)改良劑作為重金屬土壤最重要的鈍化劑之一，主要是通過提高土壤pH值和土壤顆粒表面負(fù)電荷，使重金屬吸附于土壤顆粒表面，形成氫氧化物或者碳酸鹽結(jié)合態(tài)鹽類沉淀而達(dá)到降低土壤重金屬有效態(tài)的目的[7]。石灰作為普遍使用的無機(jī)改良劑之一，其施用能有效提高土壤pH值，使土壤顆粒表面負(fù)電荷增加，促使土壤中污染重金屬元素形成氫氧化物類沉淀[8-9]。有研究表明，石灰處理提高了鉛、銅、鎘和鋅在土壤中的穩(wěn)定效率和有效態(tài)含量，降低了植物對(duì)重金屬的吸收[10-13]。錳作為一種多變價(jià)態(tài)的化學(xué)元素，在石灰作用下，其對(duì)油茶的生長(zhǎng)及生理特征的影響研究相對(duì)較少。因此，本研究通過在錳污染土壤中添加不同比例的石灰，研究錳污染土壤石灰改良對(duì)油茶生長(zhǎng)及其抗氧化酶系統(tǒng)的影響，旨在為錳污染土壤修復(fù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤樣品分別采自廣西來賓八一錳礦區(qū)（23°54′～24°01′N，109°14′～109°23′E）的采礦區(qū)及恢復(fù)區(qū)。采礦區(qū)土壤采自采礦區(qū)的表層土壤，恢復(fù)區(qū)土壤采自采礦區(qū)上游3 km處自然恢復(fù)區(qū)表層土壤。土壤采集時(shí)先去除地表雜物，然后采用蛇形5點(diǎn)法采集0～20 cm的土壤，混合均勻后，置于塑料袋中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。土壤經(jīng)自然風(fēng)干后，一部分過4 mm篩，另一部分過0.149 mm的尼龍篩備用。土壤理化性質(zhì)見表1。油茶苗購(gòu)于廣西壯族自治區(qū)桂林市林業(yè)科學(xué)研究所。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取上述過4 mm篩的土壤樣品5.0 kg，置于直徑為18 cm、高為23 cm的圓形塑料花盆中，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%（S1）和0.10%（S2）的石灰，以不添加石灰為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。選擇生長(zhǎng)一致，且高約為25 cm的油茶幼苗進(jìn)行栽培，每盆1株，共9盆，置于廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院溫室中培養(yǎng)。在25±0.5℃條件下培養(yǎng)90 d（2017年5月3日—8月3日），每隔1 d采用稱重法保持土壤含水率維持在田間最大含水率的70%。

1.3 取樣與測(cè)定

1.3.1 土壤中重金屬的形態(tài)分析

土壤重金屬形態(tài)測(cè)定方法采用歐盟BCR三步連續(xù)提取法[14-15]。提取形態(tài)分別為可交換態(tài)（F1）、可還原態(tài)（F2）、可氧化態(tài)（F3）和殘?jiān)鼞B(tài)（F4）。

1.3.2 植物收獲及錳含量的分析

培養(yǎng)90 d后，將植物樣品從土壤中取出，用自來水沖凈，再浸入 20 mmol·L-1的 EDTA-Na2溶液中交換20 min，以除去附著的重金屬，最后用去離子水洗凈，用吸水紙將水分吸干，天平稱量生物量。將植物根、莖和葉分別裝入信封，在105℃烘箱中殺青30 min后，在70℃下烘干至恒質(zhì)量。烘干的植物樣品用不銹鋼粉碎機(jī)磨碎，用于分析重金屬含量。根際土壤pH值及植物重金屬含量測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]。

表1 土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical characters of test soil

1.3.3 葉片葉綠素、類胡蘿卜素、O-·2和MDA含量的分析

葉綠素、類胡蘿卜素和O-2·的分析參考李合生[17]的方法。MDA的分析采用Quan等[18]的分析方法。

1.3.4 葉片抗氧化酶活性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.20 g已去除葉脈且剪碎的葉片于預(yù)冷的研缽中，加入1.00 mL預(yù)冷的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液，冰浴上研磨成勻漿后，加緩沖液至體積為8.00 mL。在4℃條件下10 000 r·.min-1離心15 min，上清液即為粗提液，用于SOD、催化酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸（APX）活性的測(cè)定。SOD、CAT、POD和APX的分析參考Wu等[19]和Parida等[20]的方法。

1.3.5 葉片巰基（-SH）、谷胱甘肽（GSH）和植物螯合肽（PCs）含量的測(cè)定-SH、GSH和PCs的分析采用El-Zohri等[21]的分析方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

文中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。方差分析采用SPSS 19.0軟件完成，繪圖采用Excel 2010軟件完成。

植物提取系數(shù)（PEC）=植物體內(nèi)總錳含量（mg·kg-1）/土壤錳總量（mg·kg-1）

生物累積系數(shù)（BAF）=植物體內(nèi)總錳含量（mg·kg-1）/土壤有效態(tài)錳含量（mg·kg-1）

2 結(jié)果與分析

2.1 石灰添加對(duì)根際土壤pH值及土壤錳形態(tài)的影響

如表2所示，在植物收獲后，石灰添加顯著增加了根際土壤pH值（P＜0.05）。S1處理下，采礦區(qū)和恢復(fù)區(qū)油茶根際土壤pH值比對(duì)照增加了0.42個(gè)和0.49個(gè)單位；S2處理下，采礦區(qū)和恢復(fù)區(qū)油茶根際土壤pH值比對(duì)照增加了0.84個(gè)和0.75個(gè)單位。由圖1可知，在采礦區(qū)和恢復(fù)區(qū)土壤中，石灰處理降低了土壤中可交換態(tài)錳含量，采礦區(qū)S1和S2處理分別較對(duì)照降低了18.70%和11.24%，恢復(fù)區(qū)中分別較對(duì)照降低了19.26%和32.59%。采礦區(qū)土壤中可還原態(tài)和可氧化態(tài)含量較對(duì)照含量增加，其中可氧化態(tài)增加顯著（P＜0.05），S1和S2處理分別較對(duì)照增加了20.21%和23.91%?；謴?fù)區(qū)土壤中，可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)錳的含量雖然有所變化，但較對(duì)照均沒有顯著差異（P＞0.05）。

表2 石灰添加對(duì)油茶根際土壤pH值的影響Table 2 Effect of rhizosphere soil pH of C.oleifera.under different lime addition level

圖1 石灰添加對(duì)采礦區(qū)和恢復(fù)區(qū)土壤中錳形態(tài)的影響Figure 1 Fraction distribution of Mn concentration in contaminated soil in the present of C.oleifera under different lime addition levels

2.2 石灰添加對(duì)油茶錳富集和生物量的影響

在采礦區(qū)（圖2A）和恢復(fù)區(qū)（圖2B），S1處理時(shí)油茶根、葉中的錳含量分別比對(duì)照降低了46.84%、19.50%和35.90%、31.24%，采礦區(qū)莖中的錳含量提高了50.53%，但對(duì)恢復(fù)區(qū)莖中的錳含量無顯著影響（P＞0.05）。S2處理時(shí)，在采礦區(qū)，除了莖中錳含量比對(duì)照提高了37.19%外，根、葉中錳含量無顯著變化（P＞0.05）；在恢復(fù)區(qū)，根和莖中的錳含量分別比對(duì)照顯著增加了21.08%和48.90%，葉中的錳含量相對(duì)降低了14.23%。

采礦區(qū)S2處理顯著提高了油茶的株高（P＜0.05）（圖2C），株質(zhì)量變化不明顯（P＞0.05）（圖2D）；而在恢復(fù)區(qū)中，添加石灰對(duì)油茶的株高無顯著影響（P＞0.05）（圖2D），但S1處理提高了油茶的株質(zhì)量，是對(duì)照的1.37倍，S2處理時(shí)油茶的株質(zhì)量較S1處理明顯降低（P＜0.05）。由表3可知，S1處理顯著降低了恢復(fù)區(qū)中油茶的植物提取系數(shù)和生物累積系數(shù)（P＜0.05），分別比對(duì)照降低了24.53%和6.30%。而在采礦區(qū)，S1處理在一定程度上降低了油茶的植物提取系數(shù)，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 石灰添加對(duì)油茶葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

石灰添加顯著增加了采礦區(qū)油茶葉片中的葉綠素a、葉綠素b的含量及恢復(fù)區(qū)中葉綠素b的含量（P＜0.05）（圖3A和圖3B）。其中S2處理時(shí)，采礦區(qū)油茶中葉綠素a、葉綠素b的含量分別是對(duì)照的1.98倍和

圖2 石灰添加對(duì)油茶錳攝取量及生物量的影響Figure 2 Effects of lime addition on the Mn uptake capacity and biomass of C.oleifera

表3 石灰添加對(duì)油茶植物提取系數(shù)和累積系數(shù)的影響Table 3 Performance of C.oleifera on Mn phytoextraction and bioaccumulation under different lime additions

3.69 倍，恢復(fù)區(qū)油茶中葉綠素b的含量是對(duì)照的3.01倍。S1處理時(shí)，恢復(fù)區(qū)油茶中葉綠素a的含量與對(duì)照間的差異不顯著（P＞0.05），S2處理時(shí)，油茶中葉綠素a的含量是對(duì)照的1.69倍。

由圖3C可知，采礦區(qū)油茶中類胡蘿卜素的含量隨著石灰投加量的增加而增加。而恢復(fù)區(qū)土壤中，油茶中類胡蘿卜素含量相對(duì)于對(duì)照的變化不顯著（P＞0.05）。

圖3 石灰添加對(duì)油茶葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響Figure 3 Effects of lime addition on the content of chlorophyll a，chlorophyll b and carotenoid in the leaves and biomass of C.oleifera

2.4 石灰添加對(duì)油茶O-2·和MDA含量的影響

在采礦區(qū)和恢復(fù)區(qū)，石灰添加顯著增加了油茶葉片中的O-2·含量（P＜0.05），且隨著石灰添加量的增加而增加（圖4A）。S2處理時(shí)，油茶葉片中O-2·含量分別是對(duì)照的1.91倍和1.75倍。在相同的處理?xiàng)l件下，采礦區(qū)油茶葉片中O-2·含量高于恢復(fù)區(qū)。

由圖4B可知，在采礦區(qū)，在S2處理時(shí)，油茶葉片中MDA含量比對(duì)照提高了42.1%（P＜0.05）。在恢復(fù)區(qū)，石灰添加顯著提高了油茶葉片中MDA的含量（P＜0.05），S1和S2處理下MDA含量分別是對(duì)照的1.46倍和1.34倍；但是S1和S2處理之間的差異不明顯。

圖4 石灰添加對(duì)油茶葉片中O-2·及MDA含量的影響Figure 4 Effects of lime addition on the content of O-2·and MDA in leaves of C.oleifera

2.5 石灰添加對(duì)油茶抗氧化酶活性的影響

由表4可知，在采礦區(qū)，石灰添加提高了油茶葉片中SOD、POD活性，S1和S2處理SOD活性分別是對(duì)照的1.23倍和1.40倍，POD活性分別是對(duì)照的1.47倍和1.75倍。而在恢復(fù)區(qū)，石灰的添加對(duì)油茶葉片中SOD、POD活性的影響不顯著（P＞0.05）。在采礦區(qū)和恢復(fù)區(qū)，S2處理顯著提高了油茶葉片中CAT活性（P＜0.05），分別是對(duì)照的6.02倍和2.11倍。S1處理顯著提高了恢復(fù)區(qū)油茶葉片中APX的活性（P＜0.05），為對(duì)照的2.75倍。

2.6 石灰對(duì)油茶-SH、PCs、GSH含量的影響

圖5 石灰對(duì)油茶葉片中-SH、PCs、GSH含量的影響Figure 5 Effects of lime addition on the content of-SH，PCs and GSH in the leaves of C.oleifera

由圖5A可知，在采礦區(qū)，石灰添加顯著提高了油茶葉片中-SH 和 PCs的含量（P＜0.05）。S2處理時(shí)，-SH和PCs的含量分別是對(duì)照的1.34倍和1.45倍。但是石灰的添加顯著降低了油茶葉片中GSH的含量，在S1處理時(shí)，GSH的含量比對(duì)照降低了53.46%。

在恢復(fù)區(qū)，S2處理油茶葉片中-SH、PCs和GSH的含量分別比對(duì)照降低了23.27%、22.26%和29.61%，且差異顯著（P＜0.05）（圖5B）。而S1處理時(shí)，油茶葉片中-SH和PCs的含量與對(duì)照無顯著差異（P＞0.05）；但GSH的含量顯著提高了38%（P＜0.05）。

表4 石灰添加對(duì)油茶葉片中抗氧化酶含量的影響Table 4 Effects of lime addition on the antioxidant enzyme activity in the leaves of C.oleifera

3 討論

石灰是一種常見的污染土壤改良劑，很多研究均表明施加石灰能有效提高土壤pH值，降低重金屬在土壤中的有效態(tài)，從而減少重金屬的生物可利用性。本研究結(jié)果表明，石灰添加顯著增加了根際土壤pH值（P＜0.05），降低了土壤中可交換態(tài)錳的含量。這可能是因?yàn)槭姨幚硖岣吡送寥纏H值，增加了土壤表面膠體的負(fù)電荷量，從而增加了對(duì)陽離子Mn2+的吸附，同時(shí)pH值升高，形成重金屬陽離子羥基態(tài)，增加了重金屬的專性吸附，土壤中Mn2+開始水解為Mn（OH）2+，從而使可交換態(tài)重金屬含量降低[22]。

土壤中Mn（OH）2+的形成，降低了Mn2+的濃度，不利于植物對(duì)Mn2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。在本研究S1處理時(shí)，采礦區(qū)和恢復(fù)區(qū)油茶根、葉中的錳含量分別比對(duì)照降低了46.84%、19.50%和35.90%、31.24%；恢復(fù)區(qū)油茶的植物提取系數(shù)和生物累積系數(shù)分別比對(duì)照降低了24.53%和6.30%，這可能與土壤中植物可利用態(tài)錳含量降低有關(guān)，與李青峰等[23]研究石灰對(duì)傘竹和麥冬等5種植物吸收重金屬影響的結(jié)果相似。另外，土壤有效態(tài)錳含量的降低，也將降低Mn2+對(duì)植物的傷害，從而有利于植物的生長(zhǎng)。在恢復(fù)區(qū)，S1處理時(shí)，株質(zhì)量增加了37%；但當(dāng)石灰添加量增加到0.10%（S2）時(shí)，油茶的株質(zhì)量明顯降低。表明過量添加石灰改變了土壤的pH值，超出了最適油茶生長(zhǎng)的pH值范圍，從而影響了油茶的生長(zhǎng)。另外，采礦區(qū)油茶的株質(zhì)量明顯低于恢復(fù)區(qū)，表明高濃度的錳污染會(huì)抑制油茶的生長(zhǎng)。這與陳楊明珠等[24]研究石灰對(duì)錳土甘蔗幼苗生長(zhǎng)的影響中的結(jié)論相似。

植物最重要的光合色素是葉綠素，其由葉綠素a和葉綠素b組成，是植物生長(zhǎng)的重要生物標(biāo)志物[25]。錳含量過高會(huì)導(dǎo)致葉綠素的合成受阻[4]。而本研究中，采礦區(qū)油茶葉片中的葉綠素a、葉綠素b的含量及恢復(fù)區(qū)中葉綠素b的含量隨著石灰投加量的增加而增加。這表明石灰的添加降低了土壤有效態(tài)錳含量，從而有效促進(jìn)了植物葉片葉綠素的合成，有利于油茶的生長(zhǎng)（圖2D）。這與詹云等[26]研究石灰對(duì)秋葵幼苗葉片葉綠素含量影響的結(jié)果相似。

氧化應(yīng)激是外界脅迫影響植物生長(zhǎng)的主要機(jī)制之一，它會(huì)進(jìn)一步影響植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和DNA[27-28]。在植物正常生長(zhǎng)情況下，植物體內(nèi)各種物質(zhì)之間處于平衡狀態(tài)，但是在植物受到重金屬脅迫后，植物體內(nèi)清除機(jī)制的平衡將被打破，導(dǎo)致葉片中大量產(chǎn)生有毒物質(zhì)MDA，造成膜脂過氧化和膜脂脫脂反應(yīng)[5]。本研究結(jié)果表明，石灰的添加不同程度地增加了油茶葉片中MDA的含量（圖4B），說明油茶受到了不同程度的脅迫。這可能與葉片中的O-2·含量增加有關(guān)，與楊賢均等[29]的研究結(jié)果相似。S2處理時(shí)，油茶葉片中O-2·含量分別是對(duì)照的1.91倍和1.75倍。且在相同的處理?xiàng)l件下，采礦區(qū)油茶葉片的O-2·含量高于恢復(fù)區(qū)，說明在錳濃度較高時(shí)，油茶葉片中O-2·含量顯著提高。這與Khoshgoftarmanesh等[30]研究鎳脅迫對(duì)黃瓜O-2·含量的影響相似，重金屬濃度的增加會(huì)顯著提高植物體內(nèi)O-2·的含量。

植物對(duì)各種脅迫的耐受性在很大程度上取決于非酶類抗氧化劑的積累以及抗氧化酶在細(xì)胞中的作用方式[25，31]。植物產(chǎn)生的 SOD、POD、APX和 CAT 等抗氧化酶在清除環(huán)境脅迫下植物產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）中發(fā)揮著重要作用[28，32]。SOD等的作用是消除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過量的O-2·等活性自由基，它可以將植物體內(nèi)的O-2·轉(zhuǎn)化為H2O2[33]。

表4和圖4A的結(jié)果說明，在外界錳濃度較高時(shí)，添加石灰能夠更好地激活油茶葉片中SOD酶活性，加速催化O-2·向H2O2的轉(zhuǎn)變。這與張青等[34]研究的石灰對(duì)重金屬脅迫下油菜葉片中SOD變化相似。除了SOD之外，細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)還可以通過其他抗氧化酶的參與來消除[31，35]。其中，POD、CAT在清除由O-2·轉(zhuǎn)化成的H2O2中起重要作用[36]。本研究結(jié)果表明，石灰添加下POD和CAT均有不同程度的提高（表4），這與許多重金屬脅迫下植物體內(nèi)POD、CAT等的變化一致[33，37-38]。

植物不僅可以通過抗氧化酶系統(tǒng)來清除活性氧物質(zhì)的脅迫，還可以通過非酶物質(zhì)消除活性氧物質(zhì)的脅迫[39]。其中GSH通過Halliwell-Asada途徑來清除H2O2[40]。有研究表明，GSH是PCs的合成前體，PCs、GSH通過與植物體中的重金屬進(jìn)行螯合作用來緩解植物體內(nèi)重金屬的脅迫，并通過直接清除ROS來降低植物對(duì)重金屬的吸收[25，41-42]。本研究的結(jié)果表明，在高濃度的錳環(huán)境中，石灰處理能夠使GSH大量轉(zhuǎn)化為PCs，使GSH含量減小，并在S1處理時(shí)達(dá)到最小，說明S1處理能夠促進(jìn)GSH在高濃度的重金屬脅迫下消除油茶體內(nèi)的H2O2。

4 結(jié)論

（1）石灰添加顯著提高了油茶根際土壤的pH值（P＜0.05），降低了土壤中可交換態(tài)錳的含量；同時(shí)，石灰處理促進(jìn)了錳在油茶莖中的累積，而降低了在根和葉中的積累。

（2）在采礦區(qū)土壤中添加石灰顯著提高了油茶葉片中葉綠素a的含量（P＜0.05），且葉綠素a的含量隨著石灰投加量的增加而增加。S1處理提高了油茶的株質(zhì)量，一定量的石灰能促進(jìn)油茶的生長(zhǎng)。

（3）石灰添加增加了油茶葉片中O-2·、MDA的含量，表明油茶受到了活性氧物質(zhì)的脅迫；而油茶通過提高葉片中SOD、POD和CAT的活性以及GSH和PCs的參與，來消除活性氧物質(zhì)對(duì)油茶的脅迫，有利于植物的生長(zhǎng)。