多囊卵巢綜合征患者外周血游離miR-21在診斷中的運(yùn)用研究

張偉新 盧孔月 文道林 曾 君 劉 琛

（中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明），廣東 深圳 518107）

多囊卵巢綜合征（PCOS）為生育期女性最為多見的內(nèi)分泌代謝異常性疾病之一，其主要表現(xiàn)為女性慢性無排卵、雄激素水平升高及卵巢多囊樣改變，多合并胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生[1]。現(xiàn)階段PCOS發(fā)病機(jī)制尚未明確，以往研究認(rèn)為該病可能與遺傳及環(huán)境因素等有關(guān)[2]。miRNA為一種含有22個核苷酸長度的單鏈非編碼RNA，能夠與靶基因mRNA 3'-端特異性結(jié)合，對靶基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA的表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致上百個mRNA和蛋白表達(dá)的變化，在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用[3]。自從在血清/血漿中發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的miRNA后，多個研究小組展開了血清/血漿miRNA水平與多種疾病關(guān)系的研究。結(jié)果表明，在患者的血清/血漿中存在著相關(guān)疾病特定的miRNA表達(dá)譜，與疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[3]。而隨著對miRNA在多種疾病中的研究不斷深入，為多囊卵巢綜合征外周血游離miRNA的篩選與鑒定以及在診斷中的應(yīng)用研究提供了可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：隨機(jī)選取我院2017年7月至2018年6月婦產(chǎn)科收治的PCOS患者30例，年齡21～39歲，平均年齡（32.2±6.5）歲；年齡選擇于我院健康體檢的健康者30例，年齡22～40歲，平均年齡（33.1±6.3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合我國頒布的多囊卵巢診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；超聲檢查確診為卵巢多囊性改變；無排卵或稀發(fā)排卵；未合并卵巢其他疾??；未達(dá)到手術(shù)指征；既往于正規(guī)醫(yī)院接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：引其他疾病所導(dǎo)致的雄激素分泌增加；處于妊娠期或哺乳期；合并其他系統(tǒng)疾??；進(jìn)階段使用激素或調(diào)制降糖藥干預(yù)。兩組患者一般臨床資料對比無差異性（P＞0.05），可進(jìn)行對比。

1.2 主要試劑：Trizol試劑（購自北京天根生物科技有限公司）；TransScript II Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒（購自北京天根生物科技有限公司）。

1.3 方法：所有納入研究患者均空腹8 h以上，采集空腹外周靜脈血，并于采血后2 h內(nèi)采用4 ℃低溫離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速為1600 r/min，取上清置于-80 ℃冰箱中備用。用于檢測miR-21的血清在采用離心機(jī)離心10 min（轉(zhuǎn)速16000 r/min）以保證血清中不含有血漿各種細(xì)胞成分，置于無RNA酶的EP管中保存待測。首先運(yùn)用TRIzol （Invitrogen）法提取血清中的總RNA，隨后采用TransScript II Green Two-Step qRTPCR SuperMix 試劑盒，按照試劑盒說明操作，對總RNA中的miRNA進(jìn)行特異的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成目標(biāo)miRNA的cDNA模板用于后續(xù)的Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，操作步驟嚴(yán)格遵守試劑盒說明書進(jìn)行，采用Q-PCR儀（ABI7500）檢測miR-21表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS2.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間對比采用t檢驗(yàn)分析，以表示；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，以%表示。診斷價(jià)值采用受試者工作曲線（ROC）下面積（AUC）評價(jià)指標(biāo)的診斷價(jià)值，采用Z檢驗(yàn)對比ROC曲線下面積。當(dāng)P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同組別人群miR-21表達(dá)水平對比：PCOS組者miR-21表達(dá)水平為（8.53±2.36），健康組miR-21表達(dá)水平為（4.78±1.27）對比具有差異性（t=4.68，P=0.00）。見表1。

表1 不同組別人群miR-21表達(dá)水平對比

表1 不同組別人群miR-21表達(dá)水平對比

分組 例數(shù) miR-21 PCOS組 30 8.53±2.36健康組 30 4.78±1.27 t值 - 4.68 P值 - 0.00

2.2 miR-21對鑒別診斷POCS和健康者的診斷價(jià)值分析：對miR-21進(jìn)行進(jìn)一步的受試者工作曲線（ROC）評估是否具有作為鑒別診斷POCS的生物標(biāo)志物的價(jià)值。結(jié)果表明：血清miR-21診斷ROCS的受試者工作曲線（ROC）下面積（AUC）為0.928（P=0.001），則miR-21對POCS具有診斷價(jià)值；選取大于5.20的截點(diǎn)時，Youden指數(shù)此時最大，則miR-21對鑒別診斷POCS具有較好的診斷價(jià)值，靈敏度為100.00%，特異度為72.70%。見圖1。

3 討 論

圖1 血清中miR-21在POCS患者和健康人群中相對表達(dá)結(jié)果

多囊卵巢綜合征為現(xiàn)階段女性人群中最為多見的內(nèi)分泌疾病之一，多合并有代謝異常及生殖功能障礙，但現(xiàn)階段其發(fā)病因素或發(fā)病機(jī)制尚未明確[5]。且近些年來的研究證實(shí)，多囊卵巢綜合征患者雄性激素分泌增加是導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂的作用因素[6]。miRNAs對機(jī)體中細(xì)胞增殖分化、凋亡及免疫中具有重要的作用[7]。miR-21為機(jī)體中分布最為廣泛的miRNAs之一。有研究表明[8-9]，miRNA在卵巢細(xì)胞中能夠通過作用于卵巢顆粒細(xì)胞，在性腺發(fā)育、激素合成分泌具有重要作用，從而促進(jìn)卵細(xì)胞的成熟。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[10]，miR-21對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡具有抑制作用，可提高小鼠的排卵率。本研究結(jié)果表明，PCOS組者miR-21表達(dá)水平為（8.53±2.36），健康組miR-21表達(dá)水平為（4.78±1.27），對比具有差異性（t=4.68，P=0.00）。血清miR-21診斷ROCS的受試者工作曲線（ROC）下面積（AUC）為0.928，選取大于5.20的截點(diǎn)時，Youden指數(shù)此時最大，則miR-21對鑒別診斷POCS具有較好的診斷價(jià)值，靈敏度為1.00，特異度為0.73（P=0.001）。綜上所述，血清miR-21在PCOS中表達(dá)水平增加，且對PCOS具有較好的診斷價(jià)值。