東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)利用有機(jī)磷增殖研究

肖宇梅，徐雯欽，蘇玉萍，2*，張立香，佘晨興，廖福萍

(1.福建師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350007；2.福建省污染控制和資源循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007)

隨著我國(guó)對(duì)海洋開(kāi)發(fā)力度的增大，海洋的生態(tài)環(huán)境和資源受到了嚴(yán)峻的考驗(yàn)，海洋經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也受其影響。隨之引發(fā)的赤潮發(fā)生的頻率和規(guī)模也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)近海海域2001—2013年間引發(fā)赤潮的種類中以甲藻門為優(yōu)勢(shì)種的有27種，次之以硅藻門為優(yōu)勢(shì)種的有20種，其他如金藻門、藍(lán)藻門、黃藻門等，共60種[1]。東海近海海域已成為我國(guó)赤潮高發(fā)區(qū)之一，東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)也已成為該海域赤潮的優(yōu)勢(shì)種[2]之一。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2001—2013年?yáng)|海原甲藻赤潮在我國(guó)每年均有爆發(fā)，其中2013年作為第一優(yōu)勢(shì)種引發(fā)赤潮多達(dá)16次[1]。東海原甲藻屬于甲藻綱，原甲藻目，原甲藻科，原甲藻屬，主要在東海長(zhǎng)江口、浙江近海至福建沿岸海域引發(fā)赤潮[3-4]。福建省是我國(guó)赤潮頻發(fā)的省份之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，福建省每年平均發(fā)生赤潮16.1起[5]。2013—2017年?yáng)|海原甲藻赤潮共12起。東海原甲藻已成為海洋研究工作者密切關(guān)注的一個(gè)藻種，探討東海原甲藻赤潮的形成機(jī)制、預(yù)警應(yīng)急以及藻種生長(zhǎng)與環(huán)境因子的關(guān)系等已成為研究熱點(diǎn)。

磷(Phosphorus，P)是微藻生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是大多數(shù)代謝結(jié)構(gòu)和功能所必需的元素[6]。海洋中的磷主要以溶解性無(wú)機(jī)磷(Dissolved inorganic phosphorus，DIP)和溶解性有機(jī)磷(Dissolved organic phosphorus，DOP)存在，且因DIP在水生系統(tǒng)中含量較低而通常成為浮游植物生長(zhǎng)的第一個(gè)限制因素[7-8]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻對(duì)DIP限制表現(xiàn)出積極的生理和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，DIP的限制影響東海原甲藻的生長(zhǎng)速率[9]，同時(shí)也在劇毒卡爾藻(Karlodiniumveneficum)[10]和米氏凱輪藻(Kareniamikimotoi)中體現(xiàn)[11]。東海原甲藻可直接利用無(wú)機(jī)磷，但其可分泌堿性磷酸酶間接利用葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、三磷酸腺苷(ATP)和核糖核酸(RNA)等有機(jī)磷(Organic phosphorus，OP)化合物維持生長(zhǎng)，與無(wú)機(jī)磷相比發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷對(duì)東海原甲藻的增殖作用稍好，對(duì)堿性磷酸酶的測(cè)定也反映出東海原甲藻對(duì)有機(jī)磷的利用方式不同[12-14]。林森杰等發(fā)現(xiàn)缺磷條件下細(xì)胞周期G1期受阻，但在缺磷培養(yǎng)基中加入有機(jī)磷ATP后，ATP等可以完全補(bǔ)充東海原甲藻的無(wú)機(jī)磷源并迅速恢復(fù)細(xì)胞分裂，東海原甲藻的轉(zhuǎn)錄組和mRNA表達(dá)與有機(jī)磷利用相關(guān)的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明東海原甲藻具有利用核酸、ATP、脂類等多種有機(jī)磷[15-16]包括葡萄糖-6-磷酸、磷肌酸、2-磷酸甘油酸、核苷酸、三磷酸腺苷等種類[13]的能力。

前人的研究主要集中在無(wú)機(jī)磷和有限種類的有機(jī)磷對(duì)東海原甲藻增殖的影響[13]。鑒于此，本文研究PM4A多磷源對(duì)東海原甲藻增殖的影響，選取了59種磷(54種有機(jī)磷、5種無(wú)機(jī)磷)作為磷源，探究東海原甲藻對(duì)有機(jī)磷的利用特性，結(jié)果對(duì)于研究東海原甲藻赤潮的發(fā)生規(guī)律和應(yīng)對(duì)措施具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 藻種的培養(yǎng)和有機(jī)磷

以東海原甲藻為研究對(duì)象，藻株來(lái)自于廈門大學(xué)海洋藻類資源研究中心(株CCMAXU-364)。所有藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)均在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照采用白色冷光源，光照強(qiáng)度2 500 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度設(shè)置為(20±1)℃，培養(yǎng)期間每天定時(shí)微振細(xì)胞培養(yǎng)板，防止藻細(xì)胞黏附及缺氧。實(shí)驗(yàn)用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。購(gòu)自于美國(guó)Biolog公司的PM4A磷源板，提供了54種有機(jī)磷(DOP)和5種無(wú)機(jī)磷(DIP)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)藻種先饑餓處理72 h以耗盡藻細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽。在紫外線滅菌后的超凈臺(tái)下，向PM4A plate微孔中加入100 μL滅菌海水，充分溶解微孔中磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)用磷源母液，將各微孔中的磷源母液轉(zhuǎn)移50 μL到細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)微孔中。細(xì)胞培養(yǎng)板各微孔中分別加入150 μL磷饑餓處理后的東海原甲藻藻液，進(jìn)行藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)體積為200 μL，設(shè)置2組平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)板同時(shí)放置于同一個(gè)光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10 d。同時(shí)為防止孔板中的培養(yǎng)液蒸發(fā)和邊緣效應(yīng)，2組培養(yǎng)板分別套上透明的塑封袋，并在空微孔中加入滅菌海水。接種后暫養(yǎng)1 d，次日起為第1天，之后每天定期放入酶標(biāo)儀(Perlong DNM-9602)中檢測(cè)各微孔的吸光度。

1.3 測(cè)定和計(jì)算方法

1.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

在徠卡顯微鏡(Leica BM-E)下用0.1 mL(20 mm×20 mm)浮游生物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)，根據(jù)公式(1)[17]計(jì)算細(xì)胞初始密度，考慮到實(shí)驗(yàn)藻種增殖期間單個(gè)細(xì)胞的體積差較大，本實(shí)驗(yàn)以生物量評(píng)價(jià)藻種在不同磷源中的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)東海原甲藻初始密度為1.04×107cells/L，于徠卡顯微鏡下拍照計(jì)算東海原甲藻的直徑大小并取其平均值，將東海原甲藻視為球體計(jì)算出體積，藻類的比重接近1，因此，可由藻類體積直接換算生物量(濕重)，藻類生物量為細(xì)胞密度乘以藻體平均體積，單位為mg/L或g/m3[17]，實(shí)驗(yàn)藻種東海原甲藻的平均體積為0.08×10-4mg/L，由此初始生物量為83.20 mg/L。

(1)

式中，N為細(xì)胞豐度(cells/L)；S為計(jì)數(shù)框面積(mm2)；S0為計(jì)數(shù)視野面積(mm2)；V0為濃縮后體積(mL)；V為計(jì)數(shù)體積(mL)；n為計(jì)數(shù)所得藻類個(gè)數(shù)(cells)。

1.3.2 酶標(biāo)儀分析

為了方便測(cè)量細(xì)胞數(shù)量，每天同一時(shí)間用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔板的OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度[18]。本研究先測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm下不同細(xì)胞密度(cells/L)對(duì)應(yīng)不同生物量(mg/L)的藻體與OD值之間的線性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)東海原甲藻生物量在OD450 nm線性關(guān)系較好。

藻體生物量(mg/L)=(OD450-0.136 1)/0.000 2(R2=0.927 2)

(2)

1.3.3 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

比生長(zhǎng)速率(μ)的計(jì)算公式(3)[19]：

μ=(lnXt-lnX0)/t

(3)

式中，X0表示初始細(xì)胞生物量(mg/L)；Xt表示t天后細(xì)胞生物量(mg/L)；t表示天數(shù)(d)。

2 結(jié)果與討論

通過(guò)單培養(yǎng)東海原甲藻結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同磷源的利用具有選擇性，圖1為不同時(shí)期單培養(yǎng)東海原甲藻時(shí)磷源生態(tài)位分布。根據(jù)每天計(jì)算的各微孔中的生物量水平和變化情況發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第8天總體生物量水平達(dá)到最高，培養(yǎng)第9天生物量水平存在下降趨勢(shì)，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第10天結(jié)束。東海原甲藻對(duì)不同磷源利用的比生長(zhǎng)率如圖2所示。

2.1 東海原甲藻對(duì)有機(jī)磷的利用差異

東海原甲藻對(duì)各磷源的利用效果和方式存在差異。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出有47種磷(5種DIP、42種DOP)可以被東海原甲藻利用。本研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻對(duì)磷酸乙醇酸(Phospho-glycolic acid)利用效果最好，次之D-甘露糖-1-磷酸(D-mannose-1-phosphate)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate)，三者可以促進(jìn)東海原甲藻的增殖，第8天生物量分別高達(dá)1 107.00、802.00和619.50 mg/L，培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)第10天的比生長(zhǎng)速率分別為0.249、0.214和0.209 d-1，東海原甲藻對(duì)部分核苷酸(3′-單磷酸胞苷，3′-AMP)、葡萄糖-6-磷酸(D-glucose-6-phosphate，G-6-P)、D-2-磷酸甘油酸(D-2-phospho-glyceric acid)的利用效果較好，3′-AMP能促進(jìn)東海原甲藻的增殖，其比生長(zhǎng)率為0.13 d-1；G-6-P比生長(zhǎng)率為0.16 d-1；D-2-磷酸甘油酸比生長(zhǎng)率為0.13 d-1。本研究結(jié)果與眾多學(xué)者在東海原甲藻對(duì)有機(jī)態(tài)磷的利用效果的研究方面的結(jié)果相似，說(shuō)明東海原甲藻在天然海水中可利用的磷源種類較多，在無(wú)機(jī)磷限制的海域可能具有較強(qiáng)的增殖能力。

從事光呼吸作用研究的學(xué)者發(fā)現(xiàn)了磷酸乙醇酸為該反應(yīng)過(guò)程提供原料。光呼吸作用曾被認(rèn)為是無(wú)用的耗能過(guò)程，但近年來(lái)的研究結(jié)果表明光呼吸過(guò)程具有重要的意義，如緩解磷不足對(duì)于光合作用的限制，從而減輕光抑制[20]。這為解釋東海原甲藻對(duì)磷酸乙醇酸的利用效果最佳提供了一個(gè)可能原因。

關(guān)于藻類吸收利用有機(jī)磷的機(jī)理，許多學(xué)者都提出了自己的理論。洪華生等認(rèn)為：一是對(duì)于小分子有機(jī)磷，其利用機(jī)制與無(wú)機(jī)磷相似，可以直接利用；二是對(duì)于大分子有機(jī)磷，可能需要通過(guò)藻類分泌如堿性磷酸酶等物質(zhì)的作用，被間接利用[21]。林森杰等探究米氏凱倫藻對(duì)G-6-P的生物利用度及分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)G-6-P可以被直接利用，認(rèn)為可能是因?yàn)槠渥鳛槎喾N代謝途徑的底物，直接攝取能節(jié)省水解有機(jī)磷和磷酸化的能量[22]。而相比于直接利用，相關(guān)誘導(dǎo)酶的合成和分泌可能需要一段時(shí)間，這可能會(huì)造成藻體生物量水平變化的差異[13]。因此，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，各種磷的利用效果的差異可能與藻類對(duì)不同磷源的利用機(jī)理和體內(nèi)酶的種類有關(guān)，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

2.2 東海原甲藻對(duì)某些有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的利用效果比較

由本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1和圖2)所知，東海原甲藻對(duì)某些有機(jī)磷的利用效果與對(duì)無(wú)機(jī)磷的利用效果相當(dāng)甚至更高。東海原甲藻利用的5種無(wú)機(jī)態(tài)磷：磷酸鹽、焦磷酸鹽、三偏磷酸鈉、三聚磷酸鹽、次磷酸鈉，其最高生物量(第8天)分別達(dá)到502.00、467.00、279.50、314.50、159.50 mg/L，培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)(第10天)生物量分別為362.00、379.50、147.00、182.00、89.50 mg/L，比生長(zhǎng)速率分別為0.14、0.15、0.06、0.08、0.01 d-1。東海原甲藻對(duì)硫代磷酸鹽(酯)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸、六磷酸肌醇(植酸)在生物量最高和培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)的生物量水平均高于無(wú)機(jī)態(tài)磷，這6種有機(jī)磷和二硫代磷酸鹽、D-G6P等磷源培養(yǎng)的東海原甲藻比生長(zhǎng)率也高于上述5種無(wú)機(jī)態(tài)磷。趙艷芳等利用NaH2PO4、G-P、ATP 和G-6-P等4種磷源對(duì)東海原甲藻進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷源對(duì)東海原甲藻的增殖作用效果比無(wú)機(jī)磷酸鹽稍好[13]，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，這表明有機(jī)磷化合物在東海原甲藻赤潮的形成過(guò)程中可能發(fā)揮著不可忽視的作用。

2.3 東海原甲藻可利用的有機(jī)態(tài)磷的酯鍵比較

3 結(jié)論

1)東海原甲藻可以利用PM4A 板上59種磷源中的47種磷，其中無(wú)機(jī)磷5種、有機(jī)磷42種，但是利用效果各不相同，對(duì)磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的利用效果較好。

2)東海原甲藻對(duì)PM4A 板上的含有C-O-P酯鍵的有機(jī)磷利用效果更好，某些有機(jī)磷對(duì)于東海原甲藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于無(wú)機(jī)磷，這表明有機(jī)磷可能成為影響東海原甲藻類生長(zhǎng)的重要磷源。