火龍果潰瘍病原菌拮抗菌株的篩選與生物防治效果初探

張振華，林 江，王文雅，許 暢，楊開樣，何世偉

(1.海口市瓊山區(qū)農(nóng)林服務(wù)中心，海南 海口 571100； 2.海南大學 熱帶農(nóng)林學院，海南 儋州 571737； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 試驗場，海南 儋州 571737)

火龍果(HylocereusundatusBritt.et Rose)屬于仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)，是一種集水果、花卉為一體的熱帶、亞熱帶果樹，其果實具有較高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值，被譽為保健食品和果品珍品[1]。該植物原產(chǎn)于中美洲，自20世紀90年代引入我國，目前在南方地區(qū)大面積種植。隨著種植規(guī)模擴大，火龍果已逐步成為我國南方地區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟收入的重要來源。

火龍果潰瘍病是目前火龍果生產(chǎn)管理中危害最嚴重的病害之一，病原菌為新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidiumdimidiatum)[2-3]。該病主要危害火龍果莖部，嚴重時導致莖稈腐爛、果實開裂，甚至引起果肉褐腐或黑腐[4-5]。目前,對該病以化學防治為主，吡唑醚菌酯、腐霉利、中生菌素、鏈霉素等藥劑對火龍果潰瘍病菌都有很好的抑制作用[6-9]，但在生產(chǎn)上很難完全控制火龍果潰瘍病的發(fā)生和蔓延。除化學防治外，選用抗性品種在一定程度上可以降低發(fā)病率[10]。這些方法各有不足之處，生物防治因其綠色、環(huán)境友好，已成為研究熱點，但受各種因素的制約，尤其是外界環(huán)境對生防菌活性的影響，防效穩(wěn)定性不高。因而，獲得防效穩(wěn)定的生防菌株，對火龍果潰瘍病進行防治，顯得尤為重要。為此，從火龍果不同生境分離拮抗細菌，對細菌進行賦值評估，篩選出有效生防菌株，隨后進行溫室防效試驗，期望獲得防治效果穩(wěn)定的菌株。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試植物：品種名稱為金都1號的紅皮紅肉型火龍果。

病原菌來源：采用病組織分離法[2]，從發(fā)生潰瘍病較嚴重的火龍果莖稈上分離菌株，經(jīng)柯赫氏法則驗證后，確定為病原菌，經(jīng)形態(tài)學、分子生物學鑒定該病原為新暗色柱節(jié)孢(N.dimidiatum)[3]，菌種保存于海南大學熱帶農(nóng)林學院儋州校區(qū)植物病理實驗室。

生防菌取樣地：海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗場火龍果基地。

培養(yǎng)基：蛋白質(zhì)培養(yǎng)基(Ⅰ)、幾丁質(zhì)酶選擇性培養(yǎng)基(Ⅱ)、纖維素酶活性測定培養(yǎng)基(Ⅲ)、產(chǎn)嗜鐵素活性測定培養(yǎng)基(Ⅳ)、葡聚糖培養(yǎng)基(Ⅴ)等5種培養(yǎng)基均參考鄭麗等[11]方法進行制備。

Ⅰ：配制A液(脫脂奶粉6.4 g，溶于240 mL水中，121 ℃滅菌1 min)、B液(瓊脂6.4 g，定容至240 mL，121 ℃滅菌20 min)，將A液與B液滅菌后混勻倒平板。

Ⅱ：NH4H2PO41.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·H2O 0.2 g、1%膠體狀幾丁質(zhì)100 mL、瓊脂20 g，pH值7.0。

Ⅲ：蛋白胨10 g、酵母粉10 g、羧甲基纖維素鈉10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g、瓊脂18 g，pH值7.0。

Ⅳ：配制A液(將60.5 mg CAS溶于50 mL去離子水；配制10 mL三價鐵溶液；將72.9 mg CTAB溶于40 mL去離子水。將上述3種溶液混合后定容至100 mL，調(diào)pH值至中性，121 ℃滅菌20 min)、B液(將30.24 g Pipes加入到900 mL WA培養(yǎng)基，用NaOH溶液將pH值調(diào)至6.8，121 ℃滅菌20 min)，將A液和B液混勻后倒平板。

Ⅴ：β-1,3-葡聚糖0.1 g、TSB 0.4 g、瓊脂1.6 g、4 g/L的剛果紅1 mL，定容至100 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集和菌株分離 樣本采集：將火龍果潰瘍病發(fā)病和非發(fā)病地塊劃分為不同小區(qū)，每個小區(qū)面積不低于100 m2。采用五點采樣法，每點間隔不少于10 m。每點選取3株，將健康植株或病株健康部分連同根際土壤一并收集。土壤取樣時先剝離表層土，采樣深度為2～5 cm，面積約0.5 m2。每個小區(qū)樣本由5次取樣混合獲得。參照 MORRIS等[12]的方法取樣：A.發(fā)病地塊的根際土；B.發(fā)病地塊染病植株的根圍土；C.發(fā)病地塊健康植株的根圍土；D.發(fā)病地塊的病株(病株上的健康部位)；E.發(fā)病地塊的健康植株；F.無病害地塊的根際土；G.無病害地塊健康植株的根圍土；H.無病害地塊的健康植株。

菌株分離：采用稀釋分離法[13]分離土壤樣本中的外生細菌。取5 g土樣、45 mL無菌水和玻璃珠加入到三角瓶中，在28 ℃、150 r/min搖床中振蕩30 min，隨后放置在80 ℃水浴中10 min；取1 mL土壤懸浮液和9 mL無菌水加入試管中，以梯度稀釋法制備10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液；分別取10-4、10-5、10-63個梯度的稀釋液各100 μL，均勻涂布在牛肉浸膏蛋白胨分離培養(yǎng)基[14]上，于30 ℃培養(yǎng)，24 h 后觀察菌落的形態(tài)；用劃線法進行分離純化，編號登記后，加入50%甘油，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

植株內(nèi)生細菌分離時，先用1%NaClO浸泡5 min，再用70%CH3CH2OH浸泡1.5 min，經(jīng)無菌水清洗確認表面消毒干凈后，采用外生細菌分離方法進行分離。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 初篩：采用平板對峙法進行篩選[13]。先用PDA平板活化火龍果潰瘍病菌，然后用打孔器取直徑5.0 mm的菌餅，接種到PDA培養(yǎng)皿中央。之后用接種環(huán)挑取細菌單菌落接種到距菌餅3 cm處，每個菌餅周圍接種4個單菌落，28 ℃黑暗培養(yǎng)，第3天記錄抑菌帶的寬度和細菌菌落直徑，將具有拮抗作用的細菌轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基平板上，劃線分離純化，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

復篩：將分離純化后的細菌再次進行平板對峙試驗，測定其抑菌作用。

1.2.3 拮抗菌株產(chǎn)酶與代謝物活性測定 蛋白酶活性測定：參照YANG等[14]的方法進行改進，用滅菌牙簽挑取處于生長旺盛期的菌株，接種于蛋白質(zhì)培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察透明圈有無，分別記錄透明圈的內(nèi)徑與外徑，每個處理重復3次。

幾丁質(zhì)酶活性測定：參照ROBERTS等[15]的方法，將細菌在以膠體狀幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，接菌后30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察透明圈有無，并記錄大小。

纖維素酶活性測定：參照王芳等[16]的方法，將菌株接到纖維素酶活性測定平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后，用1 g/L剛果紅染色1 h，再用1 mol/L NaCl浸漬1 h，觀察透明圈有無，并記錄大小(染色前先測菌落直徑，菌落直徑可用記號筆進行標記)。

產(chǎn)吲哚乙酸活性測定：參照SARWAR等[17]的方法，以1%胰蛋白胨水溶液(pH值7.2～7.6)為培養(yǎng)液，將細菌培養(yǎng)2 d，加入3～5 mL埃利希氏試劑(取C9H11NO 8 g，溶于760 mL 95% CH3CH2OH和160 mL濃鹽酸中)，觀察液面是否變紅。

產(chǎn)嗜鐵素活性測定：參照SHIN等[18]的方法接種細菌，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察并測量透明圈內(nèi)徑和外徑。

β-1,3-葡聚糖酶活性的檢測：參照王芳等[16]的方法，在葡聚糖平板上接菌后30 ℃培養(yǎng)4 h，觀察并測量透明圈的內(nèi)徑和外徑。

1.2.4 拮抗菌株的賦值評估 采用的賦值系統(tǒng)包括平板拮抗活性、拮抗菌株產(chǎn)酶與代謝物活性，賦值參考BERG等[19]的方法進行。根據(jù)初篩第5天的抑菌帶寬度，賦值分為：1，抑菌帶寬度<0.1 mm；2，抑菌帶寬度在0.1～0.5 mm(含0.5 mm)； 3，抑菌帶寬度>0.5 mm。水解酶和產(chǎn)生嗜鐵素賦值：0為無水解圈；1為水解圈在1～3 mm(含 3 mm)；2為水解圈在3～6 mm(含 6 mm)；3為水解圈>6 mm。產(chǎn)吲哚乙酸活性根據(jù)液面顏色變化，不變色時賦值0；淺紅色時賦值1；紅色時賦值2；深紅色時賦值3。

1.2.5 拮抗菌株的溫室防效測定 依據(jù)復篩和拮抗菌次生代謝物活性評價結(jié)果，選擇綜合評價較好的拮抗菌株在盆栽苗上開展試驗。處理時，將拮抗菌發(fā)酵液用滅菌水稀釋到1×108cfu/mL，用噴霧器均勻噴施于火龍果枝條上，以噴施滅菌水的處理作為空白對照。噴施處理5 d后，采用針刺法接種火龍果潰瘍病菌孢子液(1×106cfu/mL)。每個處理3個重復，在接種病原菌 10、15、20 d后，分別調(diào)查病害嚴重度并計算生防效果。

病害調(diào)查與評估參照盧芳[20]的分級方法：0級為無病癥；1級為莖面零星出現(xiàn)直徑 0.5～2 mm的褪綠凹陷小斑點；2級為莖面病斑分散，5%60%，未變黃；6級為莖面病斑變黃或完全腐爛。

病情指數(shù)=∑(病級數(shù)×該病級植株數(shù))/(最高病級×總植株數(shù))×100；

防效=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 各生境細菌的分離

通過對火龍果基地中發(fā)病地塊、無病地塊、發(fā)病植株和健康植株的莖稈、根部11個不同生境進行取樣分析，共分離到103株細菌，結(jié)果詳見表1。對不同生境分離得到的細菌種群密度和數(shù)量進行分析，發(fā)現(xiàn)不同生境存在差異，其中發(fā)病地塊病株健康根部細菌的種群密度最高，達到8×106cfu/g，其次為發(fā)病地塊病株健康莖稈部位，種群密度為6.5×106cfu/g，最低的為發(fā)病地塊健康植株莖稈部位，種群密度為5×105cfu/g。菌株數(shù)量方面，無病地塊健康植株根部分離的數(shù)量較多，占總分離數(shù)的15.53%，發(fā)病地塊根際土較少，占4.85%。

2.2 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法，初篩到15個菌株對火龍果潰瘍病菌具有一定拮抗作用，所占比例為14.56%，其中抑菌帶寬度最大的是10-4-6菌株，其抑菌帶寬度為4.62 mm。抑菌帶寬度≥3 mm的菌株有8株，占總菌株數(shù)的7.76%(表2)。

通過對復篩試驗結(jié)果的測量和觀察(圖1、圖2)發(fā)現(xiàn)，初篩具有拮抗活性的15株菌中，拮抗性強的有7-6-1、11-6-5、7-1-5、7-2-3、10-3-3等5株，連續(xù)培養(yǎng)5 d后抑菌帶寬度仍>0.5 mm，占總拮抗菌株數(shù)的33.33%，占總分離數(shù)的4.85%；拮抗性中等的有7-5-2、8-4-6、10-4-4、12-4-3等4株，5 d后抑菌帶寬度<0.5 mm，占總拮抗菌株數(shù)的26.67%，占總分離數(shù)的3.88%；拮抗性弱的有5-5-5、4-6-6、6-6-1、13-4-7、11-6-2、10-4-6等6株，培養(yǎng)5 d后抑菌帶基本消失看不見，占總拮抗菌株數(shù)的40.00%，占總分離數(shù)的5.82%。

表1 不同生境細菌分離結(jié)果Tab.1 Bacteria separation results in different habitats

表2 火龍果潰瘍病菌拮抗菌初篩結(jié)果Tab.2 Preliminary screening results of antagonistic bacteria against Neoscytalidium dimidiatum

2.3 拮抗菌株產(chǎn)酶與次生代謝物的分析

對所分離的103株細菌進行產(chǎn)酶和代謝物活性測定，結(jié)果如圖3和表3所示，103株細菌中產(chǎn)纖維素酶的有59株，占總數(shù)57.3%；產(chǎn)蛋白酶的細菌有72株，占總數(shù)69.9%；產(chǎn)嗜鐵素的細菌有69株，占總數(shù)66.9%；產(chǎn)吲哚乙酸的細菌有103株，占總數(shù)100%；所分離菌株均不產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶。103株菌株都能產(chǎn)生檢測的水解酶或者次生代謝物中的1種或多種，1/2以上能產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶和嗜鐵素，其中產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶的能力基本都為強性，極少數(shù)為中性或弱性，而產(chǎn)嗜鐵素和吲哚乙酸能力強的細菌較少。

對初篩具有拮抗活性的15個菌株采用賦值的方法進行評價和篩選，結(jié)果見表4。統(tǒng)計后，所得總分范圍為7～15分，其中7分2株，8分3株，9分2株，10分2株，12分1株，14分3株，15分2株?！?0分的有8株，占拮抗菌的53.33%，占總菌株數(shù)的7.77%。其中≥13分、具有較強拮抗?jié)摿Φ木暧?個，賦分14分的菌株編號為7-6-1、10-3-3、11-6-5，賦分15分的菌株編號為7-1-5、7-2-3。

圖1 火龍果潰瘍病菌拮抗菌復篩結(jié)果

右邊部分為對照 The right part is the control

A：蛋白酶；B：幾丁質(zhì)酶；C：β-1,3-葡聚糖酶；D：嗜鐵素；E：纖維素酶；F：吲哚乙酸

產(chǎn)酶及代謝物能力Power to produce enzymes and metabolites產(chǎn)酶的菌株數(shù)(百分比)Strains producing enzymes(percentage)纖維素酶Cellulase蛋白酶Protease幾丁質(zhì)酶Chitinase葡聚糖酶Glucanase產(chǎn)代謝物的菌株數(shù)(百分比)Strains producing metabolites (percentage)嗜鐵素Siderophore吲哚乙酸Indole acetic acid強Strong56(54.3%)62(60.1%)0(0)0(0)8(7.7%)23(22.3%)中Medium2(1.9%)2(1.9%)0(0)0(0)29(28.1%)48(46.6%)弱Weak1(0.9%)8(7.7%)0(0)0(0)32(31.1%)32(31.1%)總數(shù)Total59(57.3%)72(69.9%)0(0)0(0)69(66.9%)103(100%)

表4 火龍果潰瘍病菌拮抗菌株的賦值評價與篩選Tab.4 Assignment evaluation and screening of antagonistic strains to Neoscytalidium dimidiatum

2.4 拮抗菌株的溫室防效測定

結(jié)合初篩、復篩以及賦值評價結(jié)果，選擇其中效果比較明顯的10株菌進行溫室盆栽防效測定，結(jié)果見表5。經(jīng)過連續(xù)10～20 d觀測，防效較好的拮抗菌株為7-6-1和10-4-6，平均防效分別為50.41%、48.85%，其次為8-4-6，平均防效為40.49%。防效較差的菌株為10-4-4、11-6-5，平均防效分別僅為29.88%、20.52%。

表5 拮抗菌對火龍果潰瘍病菌的溫室防效Tab.5 Greenhouse control effect of antagonistic bacteria on Neoscytalidium dimidiatum

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

火龍果潰瘍病作為一種高發(fā)的世界性病害，嚴重影響火龍果的品質(zhì)和產(chǎn)量，進而會給國內(nèi)外的火龍果產(chǎn)業(yè)造成巨大的危害。病原學研究表明，火龍果潰瘍病原菌在自然界中主要通過無性孢子蔓延與傳播，高溫高濕的環(huán)境有利于其發(fā)病[2-4]。目前，通過室內(nèi)藥劑篩選得到一些對其有很好抑制作用的化學藥劑，但在大田防控時并沒有表現(xiàn)出很好的防治效果，尤其是在老化果園，很難有效控制該病的發(fā)生和蔓延[7-9]，為了能長期有效控制該病害，可以通過施用拮抗菌劑改善火龍果的微生態(tài)環(huán)境。

關(guān)于生防菌的分離篩選，從寄主植物生境中獲取是主要的途徑之一，而且從根圍土中分離的菌株防效更為持久和穩(wěn)定，已知從土壤中分離獲得對火龍果潰瘍病菌拮抗效果較好的菌株主要為皮氏類芽孢桿菌[21-24]。本試驗中，發(fā)病地塊病株健康根部細菌的種群密度最高。從火龍果種植地塊的11個不同生境分離菌株后，通過對峙培養(yǎng)法測定和賦值評價，最終優(yōu)選出10株菌株進行了溫室防效測定。雖然平均防效最高達50.41%，但隨觀測時間延長，防效均出現(xiàn)逐漸降低現(xiàn)象，同樣的現(xiàn)象在復篩過程中也出現(xiàn)，隨著觀察時間延長，相對應(yīng)的抑菌帶寬度逐漸減小，這些將影響拮抗菌對病原菌的持續(xù)拮抗性。新暗色柱節(jié)孢屬半知菌類節(jié)格孢屬真菌，相關(guān)研究表明，多數(shù)芽孢桿菌類生防菌對半知菌類真菌均有一定拮抗作用[21-23]，然而在實際生產(chǎn)中可有效防控火龍果潰瘍病的生防菌較少。本試驗所分離得到的15株拮抗性菌株中，溫室盆栽平均防效>40%的有3株，而在10 d防效>40%的有7株，經(jīng)過進一步鑒定與發(fā)酵條件優(yōu)化，可為該病害的防控提供有效的生防材料。拮抗菌對火龍果潰瘍病菌的溫室平均防效偏低，主要原因在于沒有進行多次噴施，在以后的試驗中可以改進。