山桐子油對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌線粒體的保護(hù)作用

潘文文，吳立明，崔 潔

(1.齊齊哈爾大學(xué)體育學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161000； 2.河北對(duì)外經(jīng)貿(mào)職業(yè)學(xué)院 體育部， 河北 秦皇島 066311； 3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150086)

山桐子，別名水冬瓜、水東桐、椅桐等，屬落葉喬木。山桐子主要分布在中國(guó)、日本、朝鮮等東亞國(guó)家，在我國(guó)主要分布在四川、陜西、云南、貴州等省份[1]。山桐子對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)性很強(qiáng)，具有耐寒、耐旱、耐高低溫等特點(diǎn)[2]。山桐子的果肉占果實(shí)總質(zhì)量的62.3%，種子占37.6%，山桐子的果實(shí)、種子、果肉都可以用作油料，但是其不同部位的含油率差距較大，果肉含油率為43.6%，種子含油率為22.4%～25.9%[3-4]。山桐子油的脂肪酸組成很豐富，不飽和脂肪酸含量達(dá)到82%以上，其中包括亞油酸66%以上、油酸6.6%以上，果肉油還含棕櫚酸5.12%，具有很高的食用價(jià)值[5]。山桐子油還含有一些甾醇類物質(zhì)β-谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇等，其中β-谷甾醇相對(duì)含量較高，山桐子油維生素E含量高達(dá)111.75 mg/g[6-7]。生育酚是一種重要的生物抗氧化劑和自由基清除劑，可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力和免疫能力[8]。當(dāng)前對(duì)于山桐子油的研究主要集中在栽培、繁育等方面，對(duì)于食用價(jià)值以及營(yíng)養(yǎng)保健方面研究甚少。

目前，大強(qiáng)度體育訓(xùn)練導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員猝死的事件頻頻發(fā)生。研究表明，力竭運(yùn)動(dòng)可以造成心肌組織功能損傷形成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、Ca2+超載以及能量代謝障礙等[9]。線粒體是能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，其主要作用是改變心肌能量代謝障礙，機(jī)體在力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多的自由基，自由基增多產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致心肌損傷[10]。本文通過(guò)建立力竭大鼠模型，研究山桐子油對(duì)力竭大鼠心肌線粒體的影響，以期為山桐子油的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

山桐子，采自福建省華安地區(qū)；正己烷，天津科密歐試劑有限公司；活性白土(食品級(jí))，濟(jì)南奧凱化工有限公司；氫氧化鉀，天津科密歐試劑有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒，上海哈靈生物科技有限公司；ATP試劑盒、Ca2+試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

50只健康SD雄性大鼠，平均體重(180±5)g，北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心(SYXK(京)2012-0004)。

TGL-16M型高速離心機(jī)，常州市金壇高科儀器廠；XB120A-SCS型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SA101型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)，江蘇賽昂斯生物科技有限公司；QM-SXT-2型索氏提取器，琪摩(上海)電子科技有限公司；RE-501L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上?？粕齼x器有限公司；安捷倫6890N+5973氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山桐子油的制備

將山桐子洗凈并晾干，稱取適量，粉碎過(guò)40目篩，放入索氏提取器中，加入正己烷，加熱回流2.5 h，減壓蒸餾并回收溶劑，得到山桐子毛油。山桐子毛油經(jīng)堿煉脫酸、白土脫色后得到山桐子油[11-12]。

1.2.2 山桐子油理化指標(biāo)測(cè)定

酸價(jià)測(cè)定，參照GB/T 5510—2011；碘值測(cè)定，參照GB/T 5532—2008；皂化值測(cè)定，參照GB/T 5534—2008；甾醇、維生素E含量測(cè)定，參照文獻(xiàn)[13] 。

1.2.3 山桐子油主要脂肪酸組成分析

山桐子油經(jīng)甲酯化后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

氣相色譜條件：安捷倫DB-624毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)；升溫程序?yàn)?55℃保持5 min，5℃/min升至240℃，保持20 min；載氣為高純度氮?dú)?，流量?.0 mL/min；柱前壓90.6 kPa；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度200℃；電子能量70 eV；接口溫度240℃；溶劑延時(shí)4 min；倍增器電壓1.5 kV；掃描范圍 40～500 u。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組以及測(cè)試

將大鼠隨機(jī)分成5組，分別為對(duì)照組，力竭運(yùn)動(dòng)組，低、中、高劑量山桐子油組，其中對(duì)照組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)，力竭運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行跑步運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，低、中、高劑量山桐子油組進(jìn)行跑步運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的同時(shí)，運(yùn)動(dòng)后2 h分別灌胃山桐子油50、100、150 mg/kg。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6周，每周6 d，周日休息。

跑步運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方法：將除了對(duì)照組之外的其余4組SD大鼠放置在運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)上進(jìn)行訓(xùn)練，第一周先進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，每組大鼠進(jìn)行0°、10 m/min、30 min的運(yùn)動(dòng)，第二周開(kāi)始每組大鼠進(jìn)行5°、20 m/min的運(yùn)動(dòng)，直至力竭，記錄大鼠運(yùn)動(dòng)的力竭時(shí)間。判斷力竭的標(biāo)準(zhǔn)為：使用毛刷刺激大鼠尾部，如果大鼠跟不上預(yù)設(shè)速度，臀部壓在跑臺(tái)上，大鼠的后肢跟隨轉(zhuǎn)動(dòng)跑臺(tái)的皮帶后拖達(dá)到30 s[14]。

在訓(xùn)練周的最后一日，待力竭運(yùn)動(dòng)組，低、中、高劑量山桐子油組進(jìn)行完力竭運(yùn)動(dòng)后，將以上4組和對(duì)照組的大鼠立即斷頭處死，取出心臟，并用生理鹽水沖凈，取心肌組織30 mg，在冰浴中將心肌組織剪成碎片，加生理鹽水制備10%的勻漿，過(guò)濾并棄濾渣，濾液在3 300 r/min下離心10 min，棄上清液，沉淀即為心肌線粒體，用生理鹽水制成線粒體混懸液，于4℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 SOD、GSH-Px、CAT、MDA、ATP、Ca2+含量測(cè)定

根據(jù)相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采取組間對(duì)比，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 山桐子油理化指標(biāo)及主要脂肪酸組成

經(jīng)測(cè)定，山桐子油酸價(jià)(KOH)為 0.864 mg/g，皂化值(KOH)為207.996 mg/g，碘值(I)為124 g/100 g ，不皂化物中甾醇相對(duì)含量為25.14%，維生素E的相對(duì)含量為18.34%。

從山桐子油中檢測(cè)出5種主要脂肪酸(見(jiàn)表1)，分別為亞油酸、棕櫚酸、油酸、棕櫚油酸和硬脂酸，其中亞油酸含量最高。

表1 山桐子油中主要脂肪酸組成

2.2 山桐子油對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌線粒體ATP合成能力以及Ca2+含量的影響(見(jiàn)表2)

由表2可見(jiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比，ATP合成能力明顯降低(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組ATP合成能力呈上升趨勢(shì)，高劑量組的ATP合成能力與力竭運(yùn)動(dòng)組相比明顯增加(P<0.05)。ATP作為直接供給心肌能量的重要高能磷酸化合物，主要在線粒體中合成，力竭運(yùn)動(dòng)后ATP含量明顯降低，導(dǎo)致了一系列代謝的異常和紊亂。山桐子油可以提高心肌線粒體內(nèi)ATP的合成能力，改善大鼠力竭運(yùn)動(dòng)之后引起的ATP含量降低。力竭運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比Ca2+含量極顯著增加(P<0.01)，低、中、高劑量山桐子油組Ca2+含量呈下降趨勢(shì)，其中高劑量山桐子油組的Ca2+含量與對(duì)照組相比不具有顯著性差異(P>0.05)，低、中劑量山桐子油組的Ca2+含量與力竭運(yùn)動(dòng)組相比明顯降低(P<0.05)，高劑量山桐子油組的Ca2+含量與力竭運(yùn)動(dòng)組相比極顯著降低(P<0.01)。鈣是心肌細(xì)胞中維持正常生理功能的重要指標(biāo)，細(xì)胞鈣代謝異常會(huì)引起機(jī)體各種功能障礙，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠線粒體進(jìn)行，力竭運(yùn)動(dòng)后，大量自由基生成，導(dǎo)致滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道打開(kāi)，使Ca2+大量釋放，使細(xì)胞漿中Ca2+含量升高，導(dǎo)致鈣超載，山桐子油中含有生育酚類物質(zhì)，是一種重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可在機(jī)體內(nèi)起穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的作用[8]，同時(shí)當(dāng)Ca2+內(nèi)流超過(guò)正常時(shí)，生育酚類物質(zhì)可以起到Ca2+拮抗劑的作用，表明機(jī)體在長(zhǎng)時(shí)間的力竭運(yùn)動(dòng)中，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)是運(yùn)動(dòng)性疲勞更為敏感的指標(biāo)，山桐子油對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+起到穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的作用。

表2 山桐子油對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌ATP合成能力 以及Ca2+含量的影響

注：各組與對(duì)照組相比，#表示有顯著差異(P<0.05)，##表示有極顯著差異(P<0.01)；與力竭運(yùn)動(dòng)組相比較，*表示有顯著差異(P<0.05)，* *表示有極顯著差異(P<0.01)。下同。

2.3 山桐子油對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌線粒體SOD、GSH-Px、CAT、MDA的影響(見(jiàn)表3)

表3 山桐子油對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌線粒體SOD、GSH-Px、CAT、MDA的影響 U/mg

由表3可見(jiàn)：力竭運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比SOD活性明顯降低(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組SOD活性呈上升趨勢(shì)，高劑量山桐子油組的SOD活性與力竭運(yùn)動(dòng)組相比明顯增加(P<0.05)；力竭運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，低、中、高劑量山桐子油組GSH-Px活性呈上升趨勢(shì)，低、中劑量山桐子油組的GSH-Px活性與力竭運(yùn)動(dòng)組相比明顯提高(P<0.05)，高劑量山桐子油組的GSH-Px活性與力竭運(yùn)動(dòng)組相比極顯著提高(P<0.01)；力竭運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比CAT活性明顯降低(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組CAT活性呈上升趨勢(shì)，高劑量山桐子油組的CAT活性與力竭運(yùn)動(dòng)組相比明顯增加(P<0.05)。機(jī)體通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的力竭運(yùn)動(dòng)之后可以導(dǎo)致心肌線粒體內(nèi)抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活性明顯下降，心肌線粒體內(nèi)自由基增多，特別是過(guò)氧化物大量堆積，抗氧化酶被大量催化歧化反應(yīng)而消耗，從而抑制SOD、GSH-Px、CAT的活性。SOD、GSH-Px、CAT具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)[15]。山桐子油具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以清除由力竭運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的大量自由基，進(jìn)而提高SOD、GSH-Px、CAT的活性。

由表3還可以看出，力竭運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比MDA含量明顯提高(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組MDA含量呈下降趨勢(shì)，高劑量山桐子油組與力竭運(yùn)動(dòng)組相比明顯降低(P<0.05)。長(zhǎng)時(shí)間力竭運(yùn)動(dòng)后MDA含量增加，MDA作為自由基與不飽和脂肪酸反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物，可以反映機(jī)體的自由基代謝變化，作為機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞具有嚴(yán)重的損傷作用，心肌損傷導(dǎo)致ATP合成能力不足，無(wú)氧酵解增加，乳酸堆積，pH下降，細(xì)胞內(nèi)酸中毒，致使線粒體腫脹[14]。山桐子油可以刺激抗氧化酶的活性，清除自由基，提高ATP合成能力，減少乳酸堆積，阻止pH降低，提高心肌收縮能力，從而降低MDA的含量，減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

3 結(jié) 論

大鼠在經(jīng)過(guò)力竭實(shí)驗(yàn)后，不同劑量的山桐子油對(duì)大鼠的心機(jī)線粒體影響不同，但均會(huì)增加ATP合成能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低Ca2+含量、MDA含量，并且以上指標(biāo)呈量效關(guān)系。因此，山桐子油對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌線粒體的保護(hù)有很好的干預(yù)作用。