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    紫蘇籽中不同蛋白組分的功能性質(zhì)研究

    2019-08-22 11:26:34武選民同紅娟代春吉常大偉
    中國油脂 2019年6期
    關鍵詞:脂粉油性紫蘇

    劉 寧,趙 佳,武選民,同紅娟,代春吉,常大偉,李 超

    (1.陜西科技大學 食品與生物工程學院,西安710021; 2.西安風吹麥浪農(nóng)產(chǎn)品技術開發(fā)有限公司,西安710003; 3.楊凌子蘇生物科技有限公司,陜西 楊凌712100)

    植物蛋白具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大、資源豐富等優(yōu)點,越來越多的科研工作者把尋找和開拓新的蛋白質(zhì)資源及提高蛋白質(zhì)利用率和附加值作為研究重點[1]。紫蘇在我國種植廣泛,是傳統(tǒng)的藥食兩用植物資源。紫蘇籽粕是紫蘇籽提油后的副產(chǎn)品,其中蛋白質(zhì)含量高且雜質(zhì)少,氣味良好且無毒無害,是良好的蛋白質(zhì)來源。目前,紫蘇籽粕僅作為動物飼料或充當肥料等,其自身價值未能得到充分利用[2],在高值化利用方面有一定的不足,因此紫蘇籽粕具有良好的開發(fā)前景。

    謝超等[3]研究了等電點法提取紫蘇籽蛋白的最佳工藝條件,最終獲得純度為88.81%(干基)的紫蘇籽蛋白。盛彩虹等[4]以大豆分離蛋白為對照,研究了紫蘇分離蛋白的功能性質(zhì),發(fā)現(xiàn)紫蘇分離蛋白的乳化穩(wěn)定性與大豆分離蛋白相當。目前,學者們的研究多集中在紫蘇籽蛋白的提取工藝,或其中某一種蛋白組分的功能性質(zhì),關于紫蘇籽中不同蛋白組分的功能性質(zhì)差異研究較少[5]。本文采用堿溶酸沉法提取紫蘇籽分離蛋白以及Osborne分級法提取紫蘇籽清蛋白、球蛋白,并對3種蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)進行研究,以期為紫蘇資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    紫蘇籽,西安風吹麥浪農(nóng)產(chǎn)品技術開發(fā)有限公司;大豆油,中糧集團食品有限公司;甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、四甲基乙二胺,生工生物工程有限公司;考馬斯亮藍R-250,美國Sigma公司;其他試劑均為分析純。

    K9840凱氏定氮儀,Membrapure A-300氨基酸分析儀,F(xiàn)YY-6D電泳儀,Q2000差示掃描量熱儀,F(xiàn)A25高剪切分散乳化機,UV-VS 2501PC紫外-可見分光光度計。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 紫蘇籽脫脂粉的制備

    將紫蘇籽用研磨機粉碎,過60目篩,取一定量紫蘇籽粉于燒杯中,加入3倍質(zhì)量的石油醚(沸程60~90℃)在室溫下攪拌30 min,提取2次,利用旋轉蒸發(fā)儀除去石油醚,置于通風櫥揮干,得紫蘇籽脫脂粉,過80目篩,收集備用。

    1.2.2 紫蘇籽及其脫脂粉的成分測定

    粗蛋白質(zhì)含量、粗脂肪含量、粗纖維含量、水分含量和灰分含量的測定分別參照GB 5009.5—2016、GB 5009.6—2016、GB/T 6434—2006、GB 5009.3—2016、GB 5009.4—2016進行。

    1.2.3 紫蘇籽不同蛋白組分的提取

    取一定量紫蘇籽脫脂粉與去離子水按料液比1∶20 混合,用2 mol/L NaOH調(diào)pH至9,于50℃下攪拌1 h后,以8 000 r/min離心5 min,取上清液,用2 mol/L HCl將上清液的pH調(diào)至4。以8 000 r/min離心5 min,取沉淀用去離子水洗滌3次。用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至中性,凍干后即得紫蘇籽分離蛋白。

    清蛋白和球蛋白采用Osborne分級法提取[6]。將紫蘇籽脫脂粉與去離子水按料液比1∶12混合后充分攪拌2 h,于4℃下以10 000 r/min離心30 min,重復提取2次取上清液(沉淀收集用于提取球蛋白)。將上清液pH調(diào)為4,靜置30 min,于4℃下以10 000 r/min離心15 min,取沉淀復溶調(diào)pH至中性,透析2 d,凍干得紫蘇籽清蛋白。將清蛋白提取時收集的沉淀用2%的NaCl溶液按料液比1∶12混合攪拌2 h,于4℃下以10 000 r/min離心15 min,重復提取2次合并上清液,用HCl將上清液pH調(diào)為4,靜置30 min,于4℃下以10 000 r/min離心15 min,取沉淀復溶,調(diào)pH至中性,透析2 d后凍干,即得紫蘇籽球蛋白。由于常見植物種子中清蛋白、球蛋白功能特性較好[7],因此本文不再提取醇溶蛋白、谷蛋白。

    1.2.4 不同蛋白的氨基酸組成分析

    分別稱取一定量的蛋白粉于水解管中,加入5 mL 6 mmol/L的HCl,在110℃烘箱中水解24 h后冷卻,加去離子水定容到25 mL。取1 mL水解液于小燒杯中,在60℃烘箱中脫酸后加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH 2.2),過0.22 μm的濾膜,利用Membrapure A-300氨基酸分析儀測定紫蘇籽蛋白的氨基酸組成[8](色氨酸經(jīng)堿水解后測定)。

    1.2.5 SDS-PAGE電泳測定

    根據(jù)Laemmli[9]的方法,電泳用濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%,分離膠質(zhì)量分數(shù)為12%,用0.025 mmol/L Tris-Gly緩沖液溶解蛋白樣品,取10 μL樣品加入到每個孔中。用0.1%的考馬斯亮藍R-250染液染色180 min,洗脫液為甲醇-冰醋酸-水(體積比1∶1∶8),洗脫4次。所得結果與Marker進行對照分析。

    1.2.6 差示掃描量熱法(DSC)圖譜分析

    準確稱取2 mg蛋白樣品,置于空鋁盤中,加入10 μL蒸餾水后密封。用一個空鋁盤作為對照,參數(shù)設置為:溫度掃描范圍0~155℃,升溫速率6℃/min,氮氣流速55 mL/min[10]。

    1.2.7 不同蛋白的持水性及持油性測定

    1.2.7.1 持水性的測定

    稱取1.0 g蛋白樣品置于50 mL離心管中,向離心管中加入30 mL pH為7的去離子水,在常溫下攪拌1.5 h,以8 000 r/min離心10 min,收集沉淀,記錄沉淀與離心管的總質(zhì)量,按下式計算每克樣品對水的保持量。

    式中:m0為蛋白樣品的質(zhì)量,g;m1為離心管質(zhì)量,g;m2為吸水后蛋白及離心管的總質(zhì)量,g。持水性單位最后換算成mL/g。

    1.2.7.2 持油性的測定

    稱取1.0 g蛋白樣品置于50 mL離心管中,向離心管中加入20 mL食用大豆油,攪拌2 min,在常溫下靜置30 min后,以2 000 r/min離心10 min,記錄吸油后蛋白與離心管總質(zhì)量,按下式計算每克樣品對油的保持量。

    式中:m0為蛋白樣品的質(zhì)量,g;m1為離心管的質(zhì)量,g;m2為吸油后蛋白與離心管總質(zhì)量,g。持油性單位最后換算成mL/g。

    1.2.8 不同蛋白的溶解性測定

    根據(jù)Aluko等[11]的方法進行測定。取0.5 g蛋白樣品與50 mL去離子水混合均勻,將蛋白分散液的pH調(diào)為1~10,在常溫下攪拌1.5 h后,以6 000 r/min離心10 min,棄去沉淀,收集上清液,定容到100 mL容量瓶中。用凱氏定氮法測定上清液中蛋白質(zhì)含量,按下式計算蛋白溶解性。

    溶解性=W2/W1×100%

    式中:W1為原樣品中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量,g;W2為上清液中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量,g。

    1.2.9 不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)測定

    分別配制2%的蛋白溶液,將溶液pH調(diào)節(jié)為2~9,將大豆油和上述蛋白溶液按1∶3混合均勻,以20 000 r/min均質(zhì)1 min,量取均質(zhì)后的乳液50 μL,用0.1% SDS稀釋100倍后于500 nm處測定吸光度[12]。按下式計算EAI和ESI。

    式中:EAI為乳化活性,m2/g ;DF為乳液稀釋倍數(shù),本實驗中DF=100;C為蛋白質(zhì)量濃度,g/mL;?為光程,?=0.01 m;θ為油相體積分數(shù),θ=0.25;ESI為乳化穩(wěn)定性,min;A0、A10分別為均質(zhì)后0 min和10 min時的吸光度。

    2 結果與討論

    2.1 紫蘇籽及其脫脂粉的成分(見表1)

    表1 紫蘇籽及其脫脂粉的成分 %

    由表1可知,紫蘇籽中粗脂肪含量較高,達48.36%,粗蛋白質(zhì)和粗纖維含量分別為23.30%和26.32%,而紫蘇籽脫脂粉中含有較多的粗蛋白質(zhì),含量達39.85%,表明紫蘇籽脫脂粉是良好的植物蛋白資源。

    2.2 不同蛋白組分的得率

    實驗采用不同方法提取紫蘇籽脫脂粉中的蛋白質(zhì),結果發(fā)現(xiàn),紫蘇籽脫脂粉中蛋白質(zhì)含量豐富,經(jīng)堿溶酸沉法提取,分離蛋白的得率為34.75%。分級提取的清蛋白和球蛋白得率分別為12.52%和20.85%。

    2.3 氨基酸組成(見表2)

    表2 不同紫蘇籽蛋白的氨基酸組成及含量 %

    注:*表示必需氨基酸。

    由表2可知,紫蘇籽蛋白的氨基酸組成豐富,3種蛋白中必需氨基酸種類齊全,谷氨酸和精氨酸含量均較高。因此,攝入紫蘇籽蛋白可以滿足人體對必需氨基酸的需求,紫蘇籽蛋白是一種優(yōu)良的植物蛋白資源。

    2.4 SDS-PAGE圖譜(見圖1)

    圖1 不同紫蘇籽蛋白的SDS-PAGE圖譜

    由圖1可知,紫蘇籽蛋白的SDS-PAGE圖譜中均有多條清晰可見的條帶,表明紫蘇籽蛋白由多個亞基組成。清蛋白與球蛋白具有相似的條帶分布,電泳圖譜包含4條清晰可見的條帶,相對分子質(zhì)量分別為45、25、20 kDa和5~10 kDa。分離蛋白的電泳圖譜與清蛋白、球蛋白的稍有區(qū)別,清晰可見相對分子質(zhì)量范圍分別為25~36 kDa和15~20 kDa的兩個條帶,這可能由于分離蛋白采用堿溶酸沉法提取,相比清蛋白、球蛋白提取時的pH更高,能夠溶出更大相對分子質(zhì)量的蛋白組分。

    2.5 DSC圖譜(見圖2)

    圖2 不同紫蘇籽蛋白的DSC圖譜

    由圖2可知,不同紫蘇籽蛋白的DSC圖譜均只有一個光滑的吸熱峰,表明這3種蛋白組分純度較高,其吸收峰均呈向內(nèi)凹陷的單吸熱峰[13]。不同紫蘇籽蛋白的熱學特性見表3。

    表3 不同紫蘇籽蛋白的熱學特性

    由表3可知:紫蘇籽清蛋白、球蛋白和分離蛋白的熱變性溫度Td相近,分別為107.36 、104.58℃和107.45℃;與其他兩種蛋白相比,球蛋白的Td較低。半峰寬ΔTd主要反映蛋白在熱變性過程中的協(xié)同性[14],清蛋白的ΔTd小于其他兩種蛋白,表明清蛋白更易在較窄的溫度范圍發(fā)生完全變性[12],而分離蛋白完全變性所需的溫度范圍更寬。

    2.6 不同蛋白的持水性及持油性(見圖3)

    圖3 不同紫蘇籽蛋白的持水性、持油性

    由圖3可知,紫蘇籽清蛋白具有較高的持水性和持油性,分別為3.63 mL/g和3.72 mL/g,球蛋白和分離蛋白持水性分別為2.36 mL/g和2.79 mL/g。蛋白顆粒與水接觸后,會發(fā)生吸水溶脹,有報道稱適合做黏性食品的蛋白持水性處于1.49~4.72 mL/g范圍內(nèi)[15]。持油性對蛋白具有實際應用價值,球蛋白和分離蛋白的持油性分別為2.93 mL/g和3.14 mL/g,而清蛋白的持油性最高,這可能是因為其分子結構更加開放[5]。

    2.7 不同蛋白的溶解性(見圖4)

    圖4 不同紫蘇籽蛋白的溶解性

    由圖4可知,3種蛋白的溶解性變化趨勢較一致,均呈現(xiàn)出U型的溶解性曲線。當pH在等電點附近時,蛋白的溶解性都較低;當pH偏離等電點較遠時,蛋白的溶解性均逐漸增大。不同蛋白中,溶解性高低順序依次為球蛋白、清蛋白、分離蛋白;球蛋白溶解性高于其他兩種蛋白,在pH為10時達到最高,為85.3%。

    2.8 不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)(見圖5)

    由圖5可知,紫蘇籽蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性曲線都表現(xiàn)出U型趨勢。當pH為4時,3種蛋白的EAI和ESI均最低,清蛋白分別為26.1 m2/g和19.7 min,球蛋白分別為25.3 m2/g和16.6 min,分離蛋白分別為23.2 m2/g和7.1 min。當pH為9時,3種蛋白的EAI和ESI均最高。同時,當pH偏離等電點時,3種蛋白的EAI及ESI均表現(xiàn)出增加趨勢。這與姜文鑫等[5]的研究結果較為相近。

    圖5 不同紫蘇籽蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性

    3 結 論

    本研究采用堿溶酸沉法和Osborne分級法提取了紫蘇籽中分離蛋白、清蛋白和球蛋白,并研究了其功能性質(zhì)。結果發(fā)現(xiàn):紫蘇籽脫脂粉中蛋白質(zhì)含量豐富,3種蛋白中谷氨酸、精氨酸含量較高,均含有8種必需氨基酸;清蛋白和球蛋白的亞基組成相近,分離蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性;清蛋白的持水性和持油性高于其他兩種蛋白;在pH 1~10范圍內(nèi),3種蛋白的溶解性均呈現(xiàn)出U型變化趨勢,其中球蛋白的溶解性最好;在pH 2~9范圍內(nèi),球蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性均優(yōu)于其他兩種蛋白。

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