不同解凍溫度對細管凍精精子活力的影響

陳玉萌

摘 要 尋找肉牛精子最佳解凍溫度的影響。溫度是精子最敏感的外界因素之一。實踐證明，牛精液冷凍效果好壞與解凍溫度有很大關(guān)系。牛冷凍精液質(zhì)量的好壞，直接影響受胎率，影響著養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。而凍后精子活力及生存時間（解凍后37℃保存4小時精子活力）又是冷凍精液質(zhì)量中最重要的兩項指標。為此，可以通過本試驗了解不同解凍溫度對牛冷凍精子復蘇的影響，找出適宜牛細管冷凍精液的最佳解凍溫度。目的是尋找最佳的解凍溫度及解凍時間，從而提高精子凍后活力，提高受胎率。在生產(chǎn)實踐中根據(jù)具體情況選用適合的解凍溫度和解凍時間。

關(guān)鍵詞 肉牛；冷凍精液；解凍溫度；精液質(zhì)量

牛、羊精液冷凍保存技術(shù)研究主要開始于20世紀50年代，Polge[1]等用甘油作冷凍保護劑，在-79℃保存牛精液并用于輸精，于1951年產(chǎn)下世界上第一頭冷凍精液牛犢。目前，養(yǎng)牛業(yè)中已廣泛應用冷凍精液人工授精[2]，該技術(shù)極大地促進了牛生產(chǎn)性能的改進和新品種的培育。我國牛的冷凍精液劑型除顆粒凍精外，還有細管凍精。細管凍精有很多優(yōu)點，冷凍時受溫比較均勻，冷凍效果好，精液利用率高，值得推廣，大大提高了受胎率，可以培育出體格健壯、遺傳性能優(yōu)越的犢牛。優(yōu)勢不受地區(qū)、季節(jié)、公牛年齡的限制，運輸方便，細管凍精有效保存時間長，對進行牛冷凍精液的解凍方法的優(yōu)化研究具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 供試凍精的選擇

購于吉林市繁殖改良站的肉牛細管型冷凍精液提供的0.5毫升。

1.2 解凍用具

專用的消毒杯、溫度表、自備的涼開水、電爐、溫度計試驗時這些用具隨身攜帶。

1.3 方法

在溫水解凍范圍內(nèi)設(shè)計五個溫度區(qū)：38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃。設(shè)定解凍時間為10s、20s、30s三個檔。解凍后，通過光學顯微鏡在400- 600倍條件下，室溫20℃情況下，檢查解凍后精液的活力。每個溫度區(qū)和解凍時間檔設(shè)三個重復。

1.4 解凍

將細管完全淹沒盛有溫水的容器，將水溫調(diào)節(jié)至需要的溫度后，用鑷子從液氮罐中迅速抽取一支細管凍精，輕輕抖動，把帶出的液氮抖掉，立即將其放入準備好的溫水中并輕輕搖晃，一定時間后把細管取出擦掉管外水滴，剪去封口端擠一滴于載玻片上，迅速放到顯微鏡下觀察精子活力。

1.5 不同保存溫度下的精子活力

檢查完解凍時的精子活力后，將同一頭份的個樣品混合然后將混合的精浪分為兩等份用滅菌的玻璃紙封好小試管，分別放在兩個試管架上，然后將二個試管架同時分別放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)和5-8℃冰箱中保存。在37℃恒溫箱內(nèi)保存的每隔4小時檢查活力一次，5-8℃保存的每隔招小時檢查一次活力。48小時后改為每隔24小時檢查一次活力，直至10小時為止。

2 試驗結(jié)果

2.1 解凍溫度對細管凍精精子活率的影響

注：解凍溫度精子活力之間差異不顯著（P>0.05），解凍的精子活力差異極顯著（P<0.01）。

2.2 解凍時間及溫度對精子活力的影響

由表1可知： 分別應用38.0℃、38.5℃、39.0℃、39.5℃、40.0℃進行解凍：10s、20s兩個時間的解凍精子活力差異不顯著，而30s的解凍與10s、20s的解凍精子活力差異顯著。從表中可以看出，同一解凍時間下解凍溫度不同，精子活力也不同。10s解凍時：38.0℃解凍精子活力最低，38.0℃、38.5℃ 解凍精子活力與39.0℃、39.5℃、40℃解凍精子活力差異顯著，而39.0℃、39.5、40℃解凍精子活力差異不顯著；20s解凍時：38.0℃解凍精子活力最低，與38.5℃、39.0℃、39.5℃、40℃解凍精子活力差異顯著，而38.5℃、39.0℃、39.5℃、40.0℃解凍精子活力之間差異不顯著；30s解凍時：39.5℃解凍精子活力最高，與38.0℃、38.5℃、39℃、40℃解凍精子活力差異極顯著。

2.3 綜合分析

用39.5℃溫水解凍30s精子的活力最高，冷凍精液解凍后精子活力達0.53。用39.0℃溫水解30s精子的活力也較高，冷凍精液解凍后精子活力達0.47。其他溫度解凍后精子活力較低。

3 結(jié)論

3.1 討論

目前，英、法、日等國家采用低溫（5℃）緩慢解凍，新西蘭、芬蘭、瑞典、澳大利亞使用室溫（15℃）中速解凍，匈牙利、比利時、前蘇聯(lián)等20多個國家采用37-40℃快速解凍，挪威等國采用75℃均取得了良好的效果。但就世界范圍而言，大都傾向于采用35-40℃解凍。該實驗表明，在接近體溫（40℃）下解凍效果較好，解凍溫度39.5℃、30s解凍較好，保存時間較長，適合解凍后長時間保存后輸精；造成世界范圍內(nèi)解凍溫度不一致，可能主要是由于牛品種的特異性及精子膜對冷凍解凍溫度驟變的敏感性不同，膜受損傷的程度及精子的畸形率也不同，從而精子細胞表現(xiàn)出不同的活率。

3.2 結(jié)論

采用解凍溫度39.5℃、30s解凍的冷凍精液的活力的最好的，精子活力及生存時間這兩項指標都比較好。在生產(chǎn)實踐中對細管凍精進行解凍時，可根據(jù)具體情況選用適合的解凍溫度和解凍時間。根據(jù)本實驗結(jié)果建議采用解凍溫度39.5℃、解凍時間30s。

參考文獻：

[1] POLGE C， ROESON L E A. Fertilizing capacity of bull spermatozoa after freezing at-79℃[J].Nature，1952，169：626.

[2]胡建宏，王立強，李青旺.小尾寒羊精液冷凍溫度曲線初步研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2002，30（l）：85-88.