江蘇省主栽油菜品種根腫病抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測(cè)

彭琦 張椿雨 費(fèi)維新

摘要：在安徽省休寧縣田間病圃內(nèi)，利用根腫菌4號(hào)生理小種，對(duì)江蘇省主栽的30個(gè)油菜品種進(jìn)行根腫病抗性鑒定。同時(shí)，利用已報(bào)道的與抗4號(hào)生理小種位點(diǎn)PbBa8.1緊密連鎖的分子標(biāo)記A08-300對(duì)這30個(gè)品種進(jìn)行分子檢測(cè)。結(jié)果顯示，30個(gè)品種的病情指數(shù)均在47及以上，都屬于感病或高感品種。此外，分子檢測(cè)結(jié)果表明，這30個(gè)品種中都不含有抗根腫菌4號(hào)生理小種的分子標(biāo)記。目前江蘇省主栽油菜品種中沒有抗根腫病品種，各品種極易受到根腫菌的侵染，應(yīng)引起生產(chǎn)者和育種者的高度重視。

關(guān)鍵詞：江蘇省;油菜;根腫病;抗性鑒定;分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)： S435.654? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0149-03

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的一種重要土傳病害，它主要在十字花科植物間進(jìn)行傳播。根腫病最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，現(xiàn)在全世界均有分布，尤以溫帶地區(qū)發(fā)生較嚴(yán)重[1]。根腫病的蔓延速度很快，在澳大利亞的每個(gè)州根腫病都已上升為嚴(yán)重的病害問題;在加拿大阿爾伯特省2003年僅僅發(fā)現(xiàn) 800 hm2 的油菜地感染根腫病，到2010年就有3.5萬hm2土地受到根腫病菌的侵染，其中嚴(yán)重發(fā)病地塊油菜產(chǎn)量損失達(dá)到30%以上，有的田塊甚至造成絕收[2]。由于該病原菌在土壤中可以存活10年以上，并借助農(nóng)業(yè)機(jī)械跨區(qū)作業(yè)、風(fēng)媒、水媒以及種子等途徑進(jìn)行傳播。近年來，在我國長江流域冬油菜主要產(chǎn)區(qū)，油菜根腫病發(fā)生危害逐年加重，尤其是在我國四川、云南、湖北及安徽等地，油菜根腫病危害嚴(yán)重[3-4]，僅四川省發(fā)病面積就已超過20萬hm2。江蘇省局部地區(qū)已在油菜和其他十字花科蔬菜上發(fā)現(xiàn)根腫病，并存在擴(kuò)展趨勢(shì)。江蘇省屬于長江下游油菜主產(chǎn)區(qū)，油菜的常年種植面積在30萬hm2以上，因此開展油菜品種抗根腫病的評(píng)價(jià)與鑒定對(duì)江蘇省油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值。

本研究擬對(duì)江蘇地區(qū)主要栽種的30個(gè)油菜品種進(jìn)行田間根腫病抗性鑒定，同時(shí)利用已報(bào)道的與抗4號(hào)生理小種位點(diǎn)PbBa8.1緊密連鎖的分子標(biāo)記A08-300[5]對(duì)這30個(gè)品種進(jìn)行分子檢測(cè)，以期了解江蘇省目前主栽油菜品種抗根腫病現(xiàn)狀，并為江蘇省抗病油菜品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

30個(gè)油菜品種均保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源圃，含江蘇品種16個(gè)、安徽品種2個(gè)、浙江品種2個(gè)、上海品種2個(gè)、湖北品種1個(gè)、上游區(qū)品種4個(gè)、黃淮區(qū)品種2個(gè)和加拿大品種1個(gè);病圃鑒定感病對(duì)照中核雜488和抗病對(duì)照F4010-4由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院費(fèi)維新課題組提供;分子標(biāo)記檢測(cè)抗病品種ZHE-226由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張椿雨課題組提供。

1.2 油菜品種病圃（根腫菌4號(hào)小種）的鑒定

2015年，品種鑒定試驗(yàn)安排在安徽休寧根腫病鑒定試驗(yàn)病圃，病圃生理小種經(jīng)Williams系統(tǒng)鑒定為4號(hào)小種。品種共30份，感病對(duì)照為中核雜488，抗病對(duì)照為F4010-4。1個(gè)品種種5行，1行20株苗，行寬2 m，3次重復(fù)，按照隨機(jī)區(qū)組排列。油菜出苗后1周可在水溝灌溉1次保持田間有充足的水分。油菜苗期保持病圃土壤的含水量充足，以保證油菜根腫病的發(fā)病穩(wěn)定性。出苗90 d后，拔出植株，洗凈根部的泥土，調(diào)查記載油菜根腫病的發(fā)病情況。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)采用0～3級(jí)來分級(jí)，苗期油菜根腫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)為根部無病;1級(jí)為根部有細(xì)小腫瘤，體積少于根的1/3;2級(jí)為根部有中等腫瘤，體積是根的1/3～2/3;3級(jí)為根部有異常大腫瘤，體積超過根的2/3[6]。分別計(jì)算病株率及病情指數(shù)：

病株率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=∑（病株數(shù)×相應(yīng)病害級(jí)別）/（調(diào)查總株 數(shù)× 最高級(jí)別）×100;

校正系數(shù)K=50/對(duì)照品種的實(shí)際病情指數(shù);

相對(duì)病情指數(shù)=K×鑒定材料的病情指數(shù)。

品種資源的抗病性差異根據(jù)相對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行分類：免疫（I）=0;0<高抗（HR）≤5;5<抗?。≧）≤10;10<中抗（MR）≤20;20<中感（MS）≤30;30<感病（S）≤50;50<高感（HS）≤100[7]。

1.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

合成InDel（堿基缺失標(biāo)記）A08-300標(biāo)記引物[5]，引物序列如下：

正向引物（Rcr4F）：5′-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3′;

反向引物（Rcr4R）：5′-CACAATGGAGTGTTGAAATTCACT-3′。

利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取30個(gè)主栽品種及華農(nóng)抗病品種ZHE-226幼嫩葉片DNA，10 μL的PCR反應(yīng)體系為0.5 μL DNA模板，正向/反向引物（10 μmol/L）各0.2 μL，0.5 μL dNTP（0.25 nmol/L），1 μL Taq酶，加H2O補(bǔ)齊到10 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，結(jié)束后10 ℃保存。PCR產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺中進(jìn)行凝膠電泳，銀染顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜品種病圃（根腫菌4號(hào)小種）的鑒定評(píng)價(jià)結(jié)果

2015年在安徽休寧病圃鑒定了江蘇主栽品種及資源材料30份，鑒定結(jié)果表明，這30份材料對(duì)安徽休寧的根腫病4號(hào)小種都不具有抗性。由表1可知，田間病圃鑒定根腫病病株率為57%～100%;病情指數(shù)為47～100。相對(duì)病情指數(shù)分析結(jié)果表明，30個(gè)品種中有13個(gè)品種對(duì)根腫菌4號(hào)小種感病（S），其他17個(gè)品種都達(dá)到了高感（HS）。

2.2 抗性標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果（圖1）表明，利用InDel標(biāo)記A08-300引物進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)時(shí)，抗病對(duì)照目的片段序列比待檢測(cè)品種的目的片段都要小，也就是說待檢測(cè)的30個(gè)品種中都不含有抗根腫菌4號(hào)生理小種的分子標(biāo)記。

2.3 抗性標(biāo)記測(cè)序結(jié)果

為了更直觀看出分子標(biāo)記的序列差異，筆者對(duì)抗病品種和感病品種的A08-300標(biāo)記的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性標(biāo)記序列全長132 bp，而在感病品種中的標(biāo)記序列長度為139 bp。差異序列位于49 bp處，抗性標(biāo)記缺失了7個(gè)堿基，即CTGTTGC。

3 討論與結(jié)論

根腫病是近年來從歐洲、澳洲、加拿大等地迅速蔓延至我國的一種非常嚴(yán)重的十字花科植物病害，已經(jīng)嚴(yán)重影響到我國大部分地區(qū)油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。江蘇省地處長江下游，是我國油菜的重要產(chǎn)區(qū)之一。與之相鄰的安徽、浙江省均已有了對(duì)油菜根腫病的大量報(bào)道。因此，了解江蘇地區(qū)現(xiàn)有油菜品種的根腫病抗性將有助于應(yīng)對(duì)根腫病的蔓延。

我國目前發(fā)現(xiàn)的油菜根腫菌生理小種類型主要有2、4、5、7、9、13號(hào)6種[1，8-9]。其中，以4號(hào)生理小種存在的范圍最廣，造成的危害最大。在Williams鑒定系統(tǒng)中，4個(gè)鑒別寄主對(duì)4號(hào)生理小種均表現(xiàn)為感病。因此，在本研究中主要利用4號(hào)小種來鑒定江蘇油菜主栽品種的根腫病抗性。遺憾的是，病圃鑒定結(jié)果表明，江蘇目前的栽培種都不具備對(duì)根腫菌4號(hào)生理小種的抗性，大部分品種甚至對(duì)根腫菌高感病，說明應(yīng)當(dāng)加快開展抗根腫病油菜品種選育。

目前，戰(zhàn)宗祥等通過種間雜交和分子標(biāo)記輔助選擇，已經(jīng)在國內(nèi)率先育成一系列抗根腫病油菜新品系和品種，并已開發(fā)了相關(guān)分子標(biāo)記[5]。為了將這些抗病材料用于江蘇等地區(qū)抗根腫病油菜品種改良，本研究首先對(duì)江蘇油菜品種進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)江蘇品種不具備根腫病抗性的原因在于不含有相關(guān)抗性分子標(biāo)記。通過雜交，可以使江蘇的品種帶上抗性標(biāo)記，而通過分子標(biāo)記輔助選擇則可以加快育種進(jìn)程。為此，本研究對(duì)抗性標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)分析，并發(fā)現(xiàn)抗性標(biāo)記序列缺少了7個(gè)堿基。研究結(jié)果將有助于開發(fā)新的標(biāo)記用于油菜根腫病抗性品種選育。

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