大白菜ENT基因家族的鑒定與生物信息學(xué)分析

龐文玉 王安 楊寶誼

摘要：核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（nucleoside transporter，ENT）是一類具有跨膜運(yùn)輸核苷和核苷類似物的功能蛋白。為深入研究大白菜ENT基因家族的功能，利用生物信息學(xué)方法對(duì)大白菜基因組中的ENT基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其基因組信息、蛋白生理生化特征、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在大白菜基因組中共鑒定到12個(gè)ENT基因，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，可以將12個(gè)ENT基因分為2類;對(duì)大白菜ENT蛋白氨基酸序列多重比對(duì)和蛋白跨膜域的分析表明，BrENT蛋白存在11個(gè)跨膜域，為跨膜蛋白;通過(guò)MEME軟件對(duì)大白菜ENT蛋白motif的預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn)了14個(gè)比較保守的motif。染色體分析表明，ENT基因在大白菜10條染色體上不均勻分布，而且存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，推測(cè)串聯(lián)復(fù)制是ENT基因家族基因擴(kuò)增的主要方式，研究結(jié)果為在基因組范圍內(nèi)研究ENT基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜;核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;基因家族;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S634.101? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0052-05

核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類具有跨膜運(yùn)輸核苷和核苷類似物的功能蛋白，被轉(zhuǎn)運(yùn)的核苷在核苷酸合成代謝的補(bǔ)救途徑中發(fā)揮重要作用。核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為擴(kuò)散型的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（equilibrative nucleoside transporter，ENT）和富集型的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（concentrative nucleoside transported，CNT）2種類型。其中ENT在生物體內(nèi)的分布非常廣泛，ENT家族被克隆的首個(gè)成員是hENT1，其cDNA是1996年從人胎盤中克隆得到的[1]。目前，在哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、寄生蟲(chóng)和植物中均發(fā)現(xiàn)并鑒定到了ENT[2]。由于核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與癌癥、神經(jīng)和心血管病的治療，寄生蟲(chóng)病的防治以及抗病毒、人體保健等方面密切相關(guān)，因此在動(dòng)物中得到深入而廣泛的研究[3-4]。

植物核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究還僅限于模式植物擬南芥和水稻中。李劍首先從擬南芥幼苗中克隆到核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtENT1，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了研究[5]。結(jié)果表明AtENT1在擬南芥根、莖、葉、花序軸和花等器官中均有較強(qiáng)表達(dá)，且生殖生長(zhǎng)階段表達(dá)水平高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段[5]。隨后對(duì)核苷轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究表明，AtENT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)腺苷和尿苷的能力，首次證實(shí)了植物中核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[6]。Li等又報(bào)道了AtENT3的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，并對(duì)AtENT1、AtENT2、AtENT3、AtENT4、AtENT6、AtENT7和AtENT8進(jìn)行了研究與分析[7]。Wormit等利用酵母細(xì)胞研究了AtENT4、AtENT6、AtENT7和AtENT8的生化功能，發(fā)現(xiàn)AtENT4、AtENT6和AtENT7具有廣泛的底物選擇性，既能轉(zhuǎn)運(yùn)嘌呤類核苷，也能轉(zhuǎn)運(yùn)嘧啶類核苷[8]。對(duì)水稻核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究則表明OsENT2也具有核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能[9]。另有研究表明，植物核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還具有轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞分裂素的能力[9-12]，這是繼生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN家族后發(fā)現(xiàn)的第2類植物激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。對(duì)植物核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)模式的研究表明，核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因呈現(xiàn)廣譜表達(dá)性[9-11，13-15]，但是關(guān)于植物核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物學(xué)功能的研究依然比較匱乏，僅有報(bào)道表明擬南芥AtENT1通過(guò)核苷酸代謝途徑影響花粉萌發(fā)與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程[13]。

核苷酸的挽救途徑是植物適應(yīng)外界環(huán)境的一條重要代謝途徑，在植物體內(nèi)廣泛存在，并參與了多種生理過(guò)程，如胚成熟和萌發(fā)，體外器官發(fā)生，打破休眠，果實(shí)成熟，貯藏器官發(fā)育與發(fā)芽，葉片衰老，植物組織培養(yǎng)中細(xì)胞的分裂、分化和調(diào)節(jié)以及植物對(duì)外界環(huán)境的反映等，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[16]。因此，通過(guò)對(duì)植物ENT的研究，可為改善作物抗逆性、提高營(yíng)養(yǎng)利用效率和促進(jìn)養(yǎng)分的合理分配提供參考依據(jù)。

大白菜是我國(guó)北方乃至東南亞地區(qū)的重要蔬菜作物，南北各地均有栽培，也是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物。目前關(guān)于大白菜ENT（BrENT）的研究幾乎是一片空白。大白菜（栽培品種Chiifu-401-42）全基因組測(cè)序的完成使得對(duì)大白菜中相關(guān)基因家族的鑒定和功能分析成為可能。對(duì)BrENTs的研究有助于深入認(rèn)識(shí)BrENTs家族成員，了解BrENTs在種子萌發(fā)、葉片衰老、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配和再利用以及抗逆性等過(guò)程中的作用，因此，開(kāi)展BrENTs的研究具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)大白菜ENT基因家族成員進(jìn)行了鑒定和基因組注釋，并分析了其基因結(jié)構(gòu)和保守域，以期為進(jìn)一步研究BrENTs功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大白菜ENT基因家族成員的鑒定

首先，利用擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列在大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//brassicadb.org/brad/）中進(jìn)行Blast P比對(duì)篩選候選蛋白。利用搜索到的ENT蛋白的氨基酸序列對(duì)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行二次Blast P比對(duì)搜索。最后，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)、SMART數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)分析候選蛋白的保守域以驗(yàn)證ENT蛋白鑒定的準(zhǔn)確性。

1.2 大白菜ENT基因的基因組信息和染色體定位

通過(guò)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得ENT基因的序列和基因組注釋信息，并根據(jù)ENT基因在染色體上的位置和染色體的長(zhǎng)度將ENT基因定位到對(duì)應(yīng)染色體上。

1.3 大白菜ENT蛋白的生理生化分析

通過(guò)Compute pI/Mwsoftware （http：//www.expasy.ch/ tools/pi_tool.html）預(yù)測(cè)ENT蛋白的分子量和等電點(diǎn)[17]。通過(guò)TargetP軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[18]。

1.4 大白菜ENT基因的基因結(jié)構(gòu)、保守域和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

GSDS網(wǎng)站（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）[19]用來(lái)繪制ENT基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。DNAman軟件用于對(duì)ENT蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)和跨膜域的預(yù)測(cè)。MEME網(wǎng)站（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html）[20]用來(lái)預(yù)測(cè)ENT蛋白氨基酸序列中的保守motif。利用MEGA 5.0軟件，使用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用泊松校正，成對(duì)刪除和1 000次重復(fù)等建樹(shù)參數(shù)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜ENT基因家族的鑒定和注釋

根據(jù)擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列，對(duì)大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast P搜索，最終在大白菜基因組中鑒定到12個(gè)ENT基因家族成員。如表1所示，這12個(gè)ENT基因長(zhǎng)度在538～1 279 bp，編碼179～426個(gè)氨基酸，蛋白分子量在19.6～56.0 ku 之間。其中，BrENT2的開(kāi)放閱讀框和編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)，BrENT12的開(kāi)放閱讀框和編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度最短。等電點(diǎn)（pl）在5.54～9.35之間，BrENT12等電點(diǎn)最低，BrENT3等電點(diǎn)最高。根據(jù)TargetP軟件對(duì)ENT蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)表明除BrENT11和BrENT12分別定位在細(xì)胞核和液泡中，其余絕大多數(shù)ENT蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上（BrENT1～BrENT10）。

對(duì)大白菜ENT基因染色體定位（圖1）的研究表明，ENT家族成員在大白菜的10條染色體上呈現(xiàn)明顯的不均勻分布，其中9號(hào)染色體上有6個(gè)ENT基因，1號(hào)染色體上有2個(gè)ENT基因，2、5、8和10號(hào)染色體上均有1個(gè)ENT基因，在其他染色體上則沒(méi)有分布。另外，ENT基因存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，并在染色體上呈現(xiàn)2個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，其中BrENT8和BrENT9為一對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，在1號(hào)染色體上形成一個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇，BrENT1、BrENT3、BrENT5、BrENT6和BrENT7則在9號(hào)染色體上形成一個(gè)較大的串聯(lián)重復(fù)基因簇。

2.2 大白菜ENT基因結(jié)構(gòu)分析

為明確大白菜ENT基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)大白菜基因組信息獲取了每一個(gè)ENT基因的基因組序列和CDS序列信息并繪制外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖（圖2），結(jié)果表明大白菜ENT基因含有1～7個(gè)數(shù)量不等的內(nèi)含子，其中BrENT10和BrENT11均含有1個(gè)內(nèi)含子，BrENT12含有2個(gè)內(nèi)含子，BrENT4含有4個(gè)內(nèi)含子，BrENT7、BrENT8、BrENT9含有6個(gè)內(nèi)含子，而B(niǎo)rENT1、BrENT2、BrENT3、BrENT5、BrENT6則含有7個(gè)內(nèi)含子。另外，通過(guò)對(duì)基因結(jié)構(gòu)圖和基因進(jìn)化樹(shù)的比較分析發(fā)現(xiàn)基因的親緣關(guān)系越近，其基因結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子數(shù)量也越相似。

2.3 大白菜ENT蛋白的氨基酸序列比對(duì)和保守域分析

為研究大白菜ENT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，使用DNAman軟件對(duì)大白菜ENT蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)（圖3）。結(jié)果表明大白菜ENT蛋白的氨基酸序列比較保守，并含有ENT蛋白家族典型的11個(gè)跨膜域（圖4）[7]。推測(cè)大白菜ENT蛋白是跨膜蛋白，這與上述對(duì)大白菜ENT蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜上的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致。另外，利用MEME軟件對(duì)大白菜ENT蛋白保守motif的預(yù)測(cè)分析，鑒定到了14個(gè)比較保守的motif（motif 1～14）（圖5）。

2.4 大白菜ENT基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為分析大白菜ENT基因的親緣關(guān)系和進(jìn)化模式，使用MEGA 5.0軟件對(duì)選取的大白菜及其近緣模式植物擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列構(gòu)建了NJ進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，大白菜和擬南芥ENT基因可以被聚類成兩大分支，Clade Ⅰ和Clade Ⅱ。Clade Ⅰ包含9個(gè)BrENT基因，又分為4個(gè)亞分支，其中Clade Ⅰ-a是比較大的亞分支，包含BrENT1～BrENT7 7個(gè)基因，Clade Ⅰ-b和Clade Ⅰ-c分別含有1個(gè)BrENT基因，而Clade Ⅰ-d只包含1個(gè)擬南芥ENT基因AtENT2。Clade Ⅱ包含3個(gè)BrENT基因，可以進(jìn)一步分成CladeⅡ-a和Clade Ⅱ-b 2個(gè)分支，其中BrENT10位于Clade Ⅱ-a，而B(niǎo)rENT11和BrENT12位于Clade Ⅱ-b（圖6）。

3 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列，通過(guò)對(duì)大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast P搜索，最終在大白菜基因組中鑒定到12個(gè)ENT基因家族成員，并對(duì)其家族成員進(jìn)行基因和蛋白特征分析、基因結(jié)構(gòu)分析、保守域分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析，為后期大白菜ENT基因功能研究提供了基礎(chǔ)。

基因擴(kuò)增是基因組進(jìn)化最主要的驅(qū)動(dòng)力之一，是產(chǎn)生具有新功能的基因和進(jìn)化出新物種的主要分子機(jī)制之一?；蚩梢酝ㄟ^(guò)多種方式進(jìn)行擴(kuò)增，包括全基因組復(fù)制、串連復(fù)制、片段復(fù)制和逆轉(zhuǎn)座復(fù)制等。本研究鑒定到12個(gè)大白菜ENT基因，而擬南芥基因組中共有8個(gè)ENT基因，推測(cè)大白菜ENT基因家族出現(xiàn)了基因擴(kuò)增現(xiàn)象。值得注意的是在這12個(gè)大白菜ENT基因中有8個(gè)基因分布在2個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇中，以串聯(lián)重復(fù)的形式存在，表明串聯(lián)復(fù)制是ENT基因家族基因擴(kuò)增的主要方式。BrENT8和BrENT9是一對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，其中BrENT9是AtENT7的同源基因，而在擬南芥中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BrENT8的同源基因，推測(cè)BrENT9以串連復(fù)制的形式發(fā)生后，在進(jìn)化過(guò)程中又發(fā)生了比較明顯的變異，但是其基因分化機(jī)制及具體的基因功能有待深入研究。

大白菜和擬南芥分化之前出現(xiàn)過(guò)3次全基因組復(fù)制事件（α、β、γ復(fù)制事件），分化發(fā)生之后大白菜基因組又發(fā)生了全基因組三倍化事件[22]。由于基因組加倍后，會(huì)伴隨著發(fā)生染色體重排，基因丟失等現(xiàn)象。大白菜ENT基因家族成員數(shù)量只有擬南芥的1.5倍，說(shuō)明伴隨著大白菜基因組三倍化事件也產(chǎn)生了大量的基因丟失事件，尤其是在大白菜基因組中沒(méi)有鑒定到AtENT2的同源基因，其基因丟失具體的發(fā)生機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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