基于磁珠的核酸快速提取和純化

張翠真， 袁小龍， 陳志和， 毛振方， 簡少卿,2， 趙大顯，2

(1. 南昌大學 生命科學學院， 南昌 330031； 2. 江西省水產動物資源與利用重點實驗室， 南昌 330031)

核酸的分子生物學技術是進行病原微生物檢測、物種鑒定、物種起源、多樣性評估及其親緣關系、系統(tǒng)進化等常用研究手段之一。能否提取出高質量的核酸則是分子生物學實驗中的關鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關系到后續(xù)試驗的成敗。因此，核酸提取是分子生物學最關鍵的方法之一[1]。

隨著分子生物學的廣泛應用，對核酸提取技術也提出了新的要求，高效、便捷、環(huán)保、大通量、自動化成為核酸提取技術發(fā)展的主流方向。從第1代化學法[2-6]，如酚-氯仿法、Trizol法，到第2代吸附柱法[2]，以及近年發(fā)展起來的第3代磁珠法[7-11]，其提取技術和效率不斷地改進優(yōu)化。

本研究通過納米磁珠法提取純化細菌基因組DNA、總RNA和質粒DNA，并與試劑盒法和Trizol法提取效果進行比對分析，以期獲得最佳的提取方法，為核酸提取技術提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料

SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒購自上海生工，Universal Genomic DNA Extraction Kit購自Takara，Trizol試劑購自ABI。細菌 RNAOμT購自北京天恩澤基因科技有限公司。

PCR所需引物序列上游(5′-CAATATCAGCGATGCCGAACGTAT-3′)和下游引物(5′-TACCATCACCTACCACCGAGATAA-3′)均由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA提取

試劑盒法按照Universal Genomic DNA Extraction Kit說明書要求操作。

納米磁珠法提取大腸桿菌基因組DNA：取2 mL大腸桿菌DH10B(E.coliDH10B)培養(yǎng)液，9000 r/min離心，加入500 μL Lysis buffer II，混勻，室溫裂解5 min，加入200 μL氯仿/異戊醇(24∶ 1)，振蕩30 s，13 000 r/min離心5 min；取200 μL上清液加入200 μL磁珠懸液，振蕩混勻，室溫吸附5 min，靜置 20 s，吸出上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混勻，靜置 20 s，吸出上清液；加入70 μL TE buffer，混勻，室溫放置10 min，靜置20 s，保存?zhèn)溆?；測定核酸樣品的A260，A260/A280，計算回收率，1%的瓊脂糖凝膠電泳測定基因組DNA質量。

1.2.2 PCR 檢測

將兩種方法提取的基因組DNA稀釋至30 ng/μL進行PCR擴增。

25 μL PCR反應體系：5 μL 5×PCR buffer，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)，0.5 μL下游引物(10 μmol/L)，0.5 μL dNTP mix(各2.5 mmol/L)，1 μL基因組DNA(30 ng/μL)，15.5 μL去離子水，0.5 μLTaqDNA polymerase(5 U/μL)，混勻。

PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，PCR反應完成后，將產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳觀察。

1.2.3 PCR 產物純化

試劑盒法按照SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒說明書操作。

納米磁珠法純化PCR產物：100 μL PCR反應液中加入500 μL buffer PB、100 μL磁珠懸浮液和500 μL無水乙醇，混勻，室溫吸附5 min，靜置 20 s，吸出上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混勻，靜置 20 s，吸出上清液后室溫晾干15 min；加入 100 μL TE buffer，混勻，室溫吸附10 min，靜置 20 s，保存?zhèn)溆谩?%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，測定純化后DNA樣品濃度，計算回收率。

1.2.4 DNA膠回收

試劑盒法按照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明書操作。

納米磁珠法膠回收DNA：從瓊脂糖凝膠中切下含目標片段的膠塊、稱重。加4倍膠重的buffer PG，50℃水浴溶解；加入100 μL 磁珠懸浮液和buffer PG等體積的無水乙醇，混勻，室溫吸附5 min，靜置 20 s，吸出上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混勻，靜置 20 s，吸出上清液，晾干 10～15 min。加入 100 μL TE bμffer，混勻，室溫吸附10 min，靜置 20 s，將 DNA 溶液轉移至新的EP管中保存。測定膠回收后DNA樣品的濃度，計算回收率，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 質粒DNA提取

試劑盒提取法按照SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒說明書操作。

納米磁珠法提取質粒DNA：將攜帶有PBV220質粒的E.coliDH10B接種于5 mL Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜；取4 mL菌液到EP管中，9000 r/min離心，加入250 μL Buffer P1，吹打懸浮，加入250 μL Buffer P2，混勻，室溫裂解3 min；加入350 μL Buffer P3，混勻，室溫靜置1 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液，加入400 μL 無水乙醇和200 μL MNPS懸液，振蕩混勻，室溫吸附5 min，靜置 20 s，去除上清液，加入 500 μL 75%乙醇，混勻，靜置 20 s，去除上清液，室溫晾干15 min，加入 70 μL TE buffer，混勻，室溫放置10 min，靜置 20 s，將 DNA 溶液轉移至新的EP管中保存。測定核酸樣品的濃度、A260/A280，1%的瓊脂糖凝膠電泳測定質粒DNA樣品的完整性。

1.2.6 質粒酶切檢測

用去離子水將1.2.5中兩種方法提取的質粒DNA稀釋至50 ng/μL。

50 μL酶切反應體系：5 μL 10×QuickCut Buffer，10 μL質粒DNA(50 ng/μL)，1 μL QuickCutHind III，ddH2O補足50 μL。37 ℃孵育3 h后，將酶切產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，觀察。

1.2.7 細菌總RNA提取

試劑盒和Trizol法按說明書操作。

納米磁珠法提取E.coliDH10B總RNA：離心收集2 mL 新鮮培養(yǎng)的細菌，加入500 μL Lysis buffer I，混勻，室溫裂解5 min；加入200 μL氯仿/異戊醇(24∶ 1)，振蕩30 s，13 000 r/min離心5 min；取200 μL上清到一新的EP管中，加入200 μL MNPS懸液，振蕩混勻，室溫吸附5 min，靜置 20 s，去除上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混勻，靜置 20 s，去除上清液，室溫晾干15 min；加入 70 μL TE buffer，混勻，室溫洗脫10 min，靜置 20 s，將RNA溶液轉移至新的EP管中，-80℃保存。測定RNA樣品的濃度、A260/A280，1%的瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA樣品的完整性。

2 結果

2.1 兩種提取細菌基因組DNA方法的比較

本研究用磁珠法和試劑盒法分別從2 mL菌液中提取到83.2 μg和35.8 μg基因組DNA，A260/A280分別為1.83和1.84，兩種方法提取的基因組DNA都比較完整，未發(fā)生降解，沒有蛋白污染，用磁珠法提取的基因組DNA條帶(Lane 2)比試劑盒法提取的(Lane 1)更亮(圖1)。

M：DL2000 Marker； 1：試劑盒提取的DNA； 2：磁珠法提取的DNA

圖1E.coliDH10B基因組DNA電泳圖

Figure 1 Genomic DNA electrophoresis ofE.coliDH10B

2.2 PCR擴增結果

用兩種方法提取的基因組DNA分別作為模板,進行PCR擴增，結果均能擴增出大小1 kb左右的目的條帶(圖2)。但磁珠法提取的DNA擴增后顯示出唯一一條清晰可見的條帶(Lane 1)，而以試劑盒提取的DNA作為模板時，PCR產物中有少量微弱的非特異性條帶(Lane 2)。

M：DL2000 Marker； 1：磁珠法提取的基因組DNA作為PCR模板； 2：試劑盒提取的基因組DNA作為PCR模板

圖2E.coliDH10B蘇氨酸操縱子基因片段PCR產物電泳圖

Figure 2 Electrophoretsis of PCR product of suanine manipulation subgene fragment ofE.coliDH10B

M：DL2000 marker； 1：磁珠法直接純化的PCR產物； 2：試劑盒直接純化的PCR產物； 3：未純化的PCR產物

圖3純化后的PCR產物電泳圖

Figure 3 Electrophoresis of PCR products after purification

2.3 兩種PCR產物純化方法比較

用磁珠法和試劑盒分別對5.2 μg的PCR產物進行直接純化，純化后A260/A280分別為1.91和1.86，純化后的產物質量分別為4.6 μg和4.4 μg，經計算，回收效率分別達到88.5%和84.6%，且磁珠法直接純化的PCR產物(Lane 1)比試劑盒直接純化的PCR產物(Lane 2)亮(圖3)。

2.4 兩種DNA膠回收方法比較

實驗使用磁珠法和試劑盒法分別對3.0 μg的PCR產物DNA進行電泳并膠回收，回收后的DNAA260/A280分別為1.87和1.88，回收后的DNA質量分別為2.3 μg和2.4 μg，經計算，回收效率分別達到76.7%和80.0%，回收后電泳結果如圖4所示。

M：DL2000 marker； 1：磁珠法膠回收的DNA； 2：試劑盒膠回收的DNA； 3：未進行膠回收的DNA

圖4膠回收后的DNA電泳圖

Figure 4 The DNA electrophoresis of the recovered glue

2.5 兩種質粒DNA提取方法比較

實驗通過磁珠法和試劑盒法分別從2 mL菌液中提取到9.5 μg和10.8 μg質粒DNA，A260/A280分別為1.84和1.82。實驗使用的PBV220質粒大小為3666 bp，其中有3個Hind III酶切位點，經Hind III酶切后，理論上會產生大小依次為2727 bp、815 bp、125 bp的DNA條帶，但是實際操作過程中，125 bp的DNA片段由于質量小，很難在電泳圖譜上被觀測到。電泳圖譜顯示(圖5)，兩種方法提取的質粒電泳條帶指示的大小小于其真實大小，試劑盒法提取的質粒(Lane 4)比磁珠法提取的質粒(Lane 3)條帶更亮，磁珠法提取的質粒(Lane 3)約80%為超螺旋結構，另一部分為線性或開環(huán)質粒。試劑盒法提取的質粒(Lane 4)約90%為超螺旋結構，另外一部分為開環(huán)質粒。

M：1 kb DNA ladder； 1：磁珠法提取的質粒Hind III酶切產物； 2：試劑盒提取的質粒Hind III酶切產物； 3：磁珠法提取的質粒； 4：試劑盒提取的質粒

圖5PBV220質粒DNA及其酶切電泳圖

Figure 5 PBV220 plasmid DNA and its enzymatic electrophoresis

2.6 3種細菌總RNA提取方法比較

磁珠法、試劑盒與Trizol法提取的細菌總RNA濃度分別為138、94和105 ng/μL，A260/A280分別為1.89、1.88和1.74。由圖6可知，3種方法提取的總RNA有3條帶，從上到下依次為23S rRNA，16S rRNA 和5S rRNA。其中23S rRNA 的亮度約是16S rRNA 的2倍，且條帶清晰透亮，無明顯的拖尾現(xiàn)象，說明RNA 的完整性很好。

M：DL2000 marker； 1：磁珠法提?。?2：試劑盒提??； 3：Trizol提取

圖6E.coliDH10B總RNA電泳圖

Figure 6 Total RNA electrophoresis ofE.coliDH10B

3 討論

表面修飾的磁性納米粒子作為新型的功能材料, 具有磁響應性和生物安全性[12]。在生物醫(yī)藥方面已得到廣泛應用。磁珠法提取核酸是利用磁性納米粒子與核酸結合, 在外磁場的作用下達到分離純化核酸的目的[13]。Qie等[14]應用聚酰胺-胺型樹枝狀高分子PAMAM對DNA的結合效應將其修飾在鐵磁性納米粒子表面, 應用修飾后的粒子提取DNA, 此方法較為新穎。對比各種傳統(tǒng)方法證明磁珠修飾法的提取效率高及過程較為便捷[15]。

由磁珠法和試劑盒法提取基因組DNA的A260/A280值在1.8～2之間可知，兩種方法提取的基因組DNA均沒有蛋白質污染，且磁珠法從2 mL菌液中提取的基因組DNA量多于試劑盒法，從而得出磁珠法提取效率高于試劑盒法。從圖1中兩種提取方法的亮度也可知，磁珠法提取效率高于試劑盒法，同時兩種方法提取的基因組DNA都比較完整，未發(fā)生降解。但磁珠法提取的DNA中混有少量的RNA,可能是由于細胞裂解液中沒有添加RNase A所致。實驗所建立的方法可以簡便而高產地提取到基因組DNA，說明本研究的方法具有良好的應用前景。

實驗采用PCR技術檢驗核酸的純度。圖2中試劑盒法提取的基因組DNA擴增后的條帶2出現(xiàn)雜帶，表明模板DNA不純，其中的雜質對TaqDNA polymerase或者引物產生了干擾作用，從而降低了PCR反應的特異性。因此相比試劑盒法，磁珠提取法得到的基因組DNA純度更高。

PCR產物一般都含有過量的引物、dNTP、DNA聚合酶和一些離子，這些成分的存在，直接影響后續(xù)的酶切、測序、雜交、克隆等反應，因此有必要將其除去。而這兩種方法提取的產物與不提純之前條帶相比相差不大，說明這兩種方法都能較好地純化PCR產物。

在分子生物學實驗中，很多情況需要利用瓊脂糖凝膠電泳觀察、純化和回收DNA片段，特別是在進行基因的預測、篩選、克隆和轉化及不同類型DNA片段進行純化和回收，然后克隆和測序，需要準確、簡便、快速、經濟的瓊脂糖凝膠DNA回收方法[16]。

質粒DNA提取效率及質量關系到分子克隆的全過程，建立高效而快速的質粒DNA提取方法對提高分子生物學研究具有重要意義[17]。傳統(tǒng)的質粒DNA提取方法大多基于離心、沉淀或色譜分離，普遍存在操作時間長、離心次數多、接觸有毒試劑及成本偏高等特點[18]。

兩種方法提取的質粒都能被限制性內切酶Hind III完全切開，酶切后的電泳條帶與理論相符，進一步說明提取到的質粒DNA純度較高，沒有抑制內切酶活性的雜質存在。

RNA是生物體內的遺傳物質，不僅可以是信息的攜帶者，還可以是功能的執(zhí)行者，在生物體內，RNA執(zhí)行著多種代謝功能。獲取高質量的RNA與分子生物學研究密切相關[19-20]，因此，如何使提取的RNA純度變得越好，濃度越高，成為深入研究的關鍵。由提取的RNA濃度可知磁珠法提取的RNA濃度最高，由Trizol法提取RNA的A260/A280值小于1.8可知，其提取的RNA純度較低。但磁珠法和試劑盒提取到的總RNA中有基因組DNA的污染，不過這些DNA能通過加入DNaseI的方法除去，而Trizol法不存在基因組DNA污染的情況，但Trizol試劑中加入了苯酚，對人體有毒性，并且苯酚的殘留將影響后續(xù)實驗。相比之下，磁珠法和試劑盒法更加環(huán)保安全。

4 結論

采用磁珠法和試劑盒法與Trizol法對核酸進行提取與純化。與試劑盒法和Trizol法相比，磁珠法在細菌基因組DNA和RNA提取、PCR產物檢測及純化中效率更高；而在PCR產物回收和質粒DNA的提取中，效率低于試劑盒法，質粒酶切效果與試劑盒法無差異。結果表明，納米磁珠法相比試劑盒法和Trizol法在核酸提取純化效果上更佳。