異甘草酸鎂注射液的穩(wěn)定性研究△

鄭富香，徐艷霞，李超，王一丹，任曉亮

天津中醫(yī)藥大學 中藥學院，天津 300193

中藥注射劑的安全性、有效性和質量可控性，不僅是國家政策的需要，也是中藥注射劑本身發(fā)展的需要，與其他中藥劑型相比，注射劑具有生物利用度高、療效確切、作用迅速的特點[1]。異甘草酸鎂注射液是正大天晴藥業(yè)股份有限公司專利獨家生產(chǎn)的國家一類新藥[2-3]，由甘草中的主要成分甘草酸，經(jīng)旋光異構化后與鎂離子成鹽形成[4]。甘草酸是評價甘草藥材、成藥質量、制劑穩(wěn)定性和制訂藥品質量標準的最重要的指標性成分，存在α和β兩種立體異構體，而異甘草酸鎂為18α甘草酸，在體內更易與受體蛋白和類固醇激素的靶細胞受體結合而發(fā)揮改善肝功能的作用[5]，是一類復合功能性的抗炎藥物，具有肝臟靶向性[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，在不同肝毒劑引起的肝損傷模型中，異甘草酸的抗肝損傷作用明顯優(yōu)于天然甘草酸[7]。研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸及其衍生物都具有抗病毒、保護肝臟、調節(jié)細胞免疫等作用[8]，這是一種肝細胞保護劑，療效優(yōu)于天然異構體，而且安全性好的高純度藥物[9]。藥效實驗顯示，異甘草酸鎂對D-氨基半乳糖引起的大鼠急性肝損傷有防治作用；對CCl4引起的大鼠慢性肝損傷也有改善作用[10-11]。本實驗通過在不同條件下對異甘草酸鎂注射液的穩(wěn)定性及配伍進行考察，為臨床和生產(chǎn)應用提供參考。

1 材料

高效液相色譜儀(SHIMADZU LC-20AT)；BT125D型十萬分之一天平、PB-10型pH計(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；KH3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

異甘草酸鎂注射液(規(guī)格：10 mL：50 mg，批號：151126204，正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司)；異甘草酸鎂對照品(由正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司提供，純度≥98%)；0.9%氯化鈉注射液(批號：B151203062，山東科倫藥業(yè)有限公司)；5%葡萄糖注射液(批號：D151113042，山東科倫藥業(yè)有限公司)；10%葡萄糖注射液(批號：D151103101，山東科倫藥業(yè)有限公司)；乳酸環(huán)丙沙星注射液(批號：D151115246，石家莊藁城區(qū)四海藥業(yè)有限公司)；HPLC分析用乙腈為色譜純，氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 檢測波長的選擇 采用UV-Vis分光光度計在190～760 nm對異甘草酸鎂對照品、異甘草酸鎂注射液進行掃描，測得最大吸收波長，且在該波長下進行HPLC分析時，制劑中其他成分對異甘草酸鎂測定無干擾，最終選擇252 nm波長下進行研究。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：252 nm；流動相：磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)-乙腈(78∶22)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1，色譜圖見1～2。

圖1 異甘草酸鎂對照品HPLC圖

圖2 異甘草酸鎂注射液HPLC圖

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取異甘草酸鎂對照品50.00 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密量取異甘草酸鎂注射液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.3 磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)的配制 精密稱取磷酸二氫鉀6.8 g，純水溶解，加入0.1 mol·L-1NaOH溶液約395 mL，加水至1000 mL，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，超聲脫氣備用[12]。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密稱取異甘草酸鎂對照品1.25 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，配制質量濃度為250 μg·mL-1的溶液，并逐級稀釋質量濃度為200、150、100、50、25、10、5、1 μg·mL-1的溶液，搖勻。按2.1.2色譜條件，分別注入HPLC中，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，異甘草酸鎂濃度為橫坐標。結果顯示，異甘草酸鎂的線性回歸方程為：Y=10 390X-24 388(r=0.999 6)，說明在1～200 μg·mL-1線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取高(150 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)3個質量濃度的異甘草酸鎂對照品溶液，分別重復進樣6次，測定其峰面積，計算異甘草酸鎂的濃度，計算RSD分別為0.345%、1.06%、2.2%，表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 將一定濃度的樣品溶液在上述色譜條件下于間隔時間為0、2、4、6、8、10、12、24 h重復進樣，測定其峰面積，計算RSD值為1.5%，表明穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗 按2.2.2項配制6份供試品溶液，進樣測定其峰面積，計算異甘草酸鎂的濃度，計算RSD為1.5%，表明重復性良好。

2.3.5 加樣回收率的考察 精密量取100 μL的異甘草酸鎂注射液于10 mL容量瓶中，加入100 μL的對照品溶液，純水定容，混勻，平行制備6次，進樣測定其峰面積，計算異甘草酸鎂的濃度，測得加樣回收率分別為97.5%、95.2%、100.4%、96.4%、96.7%、98.9%，RSD為1.8%。

2.4 異甘草酸鎂注射液在不同pH條件下的降解動力學研究

用磷酸二氫鉀、氫氧化鈉和鹽酸制備pH分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的緩沖溶液，精密量取異甘草酸鎂注射液200 μL，置于10 mL的棕色容量瓶中，分別用上述緩沖溶液定容至刻度，得到異甘草酸鎂在不同pH條件下的樣品溶液，間隔一定的時間(0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h)取樣，HPLC測定溶液中異甘草酸鎂的殘余濃度(Ct)，根據(jù)化學動力學規(guī)律，百分剩余濃度的對數(shù)ln(Ct/C0)為縱坐標，時間t為橫坐標，繪制降解曲線，見圖3。

ln(Ct/C0)=-Kt

(1)

其中Ct為t時刻藥物濃度，C0為初始時刻藥物濃度，t為反應時間，K為反應速率常數(shù)。

為研究注射液降解的機理、影響其降解的因素及預測注射液的有效期，通過化學反應動力學方法計算降解速率常數(shù)K和半衰期(t1/2)，結果見表1。

圖3 異甘草酸鎂注射液在不同pH條件下的降解動力學曲線

pHK(h-1)t0.5/ht0.9/h10.142 004.880 20.742 9620.137 005.058 30.770 1030.012 0057.750 08.791 6740.000 0513 860.000 02 110.000 00

結果顯示，異甘草酸鎂注射液在強酸(pH 1～2)條件下有明顯的降解，其他pH條件下(pH 5～12)基本無降解，與pH 4曲線圖近似，故沒有在圖表中體現(xiàn)，表明異甘草酸鎂注射液在強酸條件下不穩(wěn)定，提示不宜在此條件下提取、保存、運輸。

2.5 異甘草酸鎂注射液在不同溫度下的降解動力學研究

2.5.1 異甘草酸鎂對照品 精密量取異甘草酸鎂對照品溶液200 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，混勻，制得樣品溶液。并用HPLC測定溶液中異甘草酸鎂濃度C0。將樣品溶液密封，分別置于溫度為70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中，間隔0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取樣10 μL，測定溶液中異甘草酸鎂濃度Ct，以ln(Ct/C0)對t作圖，得到溫度對異甘草酸鎂降解速率的影響，結果見圖4。

圖4 異甘草酸鎂對照品在不同溫度下的降解動力學曲線

根據(jù)阿侖尼烏斯方程(lnK=lnA-Ea/RT)，(其中Ea為活化能)計算在70～90 ℃條件下，異甘草酸鎂對照品的降解活化能(Ea)=24.33 kJ·mol-1。

2.5.2 異甘草酸鎂注射液 精密量取異甘草酸鎂注射液200 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，混勻，制得樣品溶液。并用HPLC測定溶液中異甘草酸鎂濃度C0。將樣品溶液密封，分別置于溫度為70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中，間隔0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取樣10 μL，測定溶液中異甘草酸鎂濃度Ct，以ln(Ct/C0)對t作圖，結果見圖5。

根據(jù)阿侖尼烏斯方程(lnK=lnA-Ea/RT)，計算在70～90 ℃條件下，異甘草酸鎂注射液的降解活化能(Ea)=20.99 kJ·mol-1。

結果顯示，異甘草酸鎂注射液和對照品溶液的降解速率隨溫度的升高而加快，且注射液的降解速率對溫度變化稍不敏感，較穩(wěn)定。

2.6 異甘草酸鎂注射液在不同離子條件下的降解動力學研究

精密量取異甘草酸鎂注射液100 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，分別用不同離子儲備液(0.1 mol·L-1NaCl、CaCl2、CuCl2、AlCl3溶液)定容至刻度，混勻，制得待測樣品，以純水作對比，用UV-Vis分光光度計在0、0.5、1、3、5 h內測定異甘草酸鎂注射液的吸光度值并觀察溶液外觀變化，變化曲線見圖6。

圖6 吸光度變化曲線圖

結果顯示，隨靜置時間增加，各待測液顏色無明顯變化，且溶液澄清，無可見異物，與純水比較，加入Al3+后注射液的吸光度有明顯變化，Cu2+使注射液的吸光度明顯降低，表明異甘草酸鎂注射液在不同離子條件下未發(fā)生降解，只是與不同金屬離子發(fā)生了絡合反應導致吸光度發(fā)生變化，這可能與異甘草酸鎂三萜骨架結構有關，此研究主要的目的是為注射液的保存、運輸過程提供參考。

2.7 與臨床常用注射液配伍后的穩(wěn)定性試驗

2.7.1 與不同溶媒配伍 按臨床常用濃度，取異甘草酸鎂注射液3支，分別注入5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液，定容至10 mL，振蕩搖勻，室溫下放置。

2.7.1.1 pH值檢查 取上述溶液，分別于0、0.5、1、3、5 h觀察溶液外觀變化并測定pH，結果各配伍液在5 h內均澄明，顏色無明顯變化，無可見異物，pH變化曲線見圖7。

圖7 pH值變化曲線圖

2.7.1.2 含量測定 取上述溶液，采用紫外分光光度計分別于0、0.5、1、3、5 h下測定，可見異甘草酸鎂與3種注射液配伍后的吸光度無顯著變化，吸光度變化曲線見圖8。

圖8 吸光度變化曲線圖

結果表明，異甘草酸鎂注射液與5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液配伍后5 h內外觀、pH值、含量、可見異物等考察指標無明顯變化，說明異甘草酸鎂注射液可與3種注射液配伍且保持穩(wěn)定。

2.7.2 與乳酸環(huán)丙沙星注射液配伍 乳酸環(huán)丙沙星注射液屬于喹諾酮類抗菌藥，主要用于治療胃腸道和泌尿系感染等[13-14]，環(huán)丙沙星為合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有殺菌力強、抗菌譜廣、在組織中易于分布等特點，在臨床上應用日益廣泛，其不良反應也就隨之不斷增加[15]。

無菌注射器抽取2 mL乳酸環(huán)丙沙星液體備用，將1支異甘草酸鎂注射液加入0.9%氯化鈉溶液100 mL中，混勻稀釋備用。分別用5 mL無菌注射器取以上藥液各1 mL置于干燥試管中，兩者混合后立即出現(xiàn)白色渾濁，呈絮狀液；放置2 h后，仍呈白色渾濁絮狀液。

結果表明，乳酸環(huán)丙沙星與異甘草酸鎂注射液混合后，生成了白色渾濁的絮狀液，兩種藥物之間有相互作用，存在藥物配伍禁忌。

3 討論

本實驗所采用HPLC測定重復性、精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率較好，方法準確、可靠。

配伍穩(wěn)定性實驗表明：異甘草酸鎂注射液與5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液3種輸液配伍后，5 h內外觀、pH、含量等考察指標無明顯變化，建議臨床配伍使用。乳酸環(huán)丙沙星與異甘草酸鎂注射液混合后，生成了白色渾濁的絮狀液，表明兩種藥物之間有相互作用，存在藥物配伍禁忌，該實驗結果提示，醫(yī)護人員在臨床上聯(lián)合使用這兩種藥物時，應間隔用藥。

異甘草酸鎂注射液在強酸條件下(pH 1、2)不穩(wěn)定，分析原因可能是異甘草酸鎂自身特殊結構的影響，在強酸條件下羥基脫水，增加雙鍵結構，再經(jīng)雙鍵移位，分子縮合等原因，在高溫條件下不穩(wěn)定、發(fā)生降解，可能與結構中官能團被破壞有關，故不宜在此條件下提取、保存、運輸。金屬離子Ca2+和Na+對注射液穩(wěn)定性影響很小，而Al3+和Cu2+對其穩(wěn)定性影響很大，分析原因可能是Al3+和Cu2+的空間結構和電子排布及發(fā)生絡合反應的影響，應用過程中應注意，以上具體作用機制還需研究者繼續(xù)探討。