三種何首烏單體成分對大鼠肝損傷作用的研究△

顏玉靜，文海若，淡墨，呂建軍，王超，苗玉發(fā)，黃芝瑛，汪祺

1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心/藥物非臨床安全評價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176；3.中國食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所，北京 100050

蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的藥理學(xué)作用廣泛，包括抗腫瘤、抗菌抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、延緩動脈粥樣硬化等[1-2]。然而近年來，國內(nèi)外關(guān)于何首烏及其制劑的臨床不良反應(yīng)，尤其是肝損傷的報(bào)道逐漸增多[3-4]。臨床數(shù)據(jù)提示，何首烏可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷型、膽汁淤積型及混合型的肝損傷，常見臨床癥狀為膽汁淤積、黃疸、肝區(qū)疼痛、肝脾腫大等[5]。目前何首烏中導(dǎo)致肝損傷的具體成分及其機(jī)制仍不明確。有研究提示其致肝損傷的機(jī)制可能與抑制膽紅素代謝過程中的UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1酶)有關(guān)，如汪祺等[6-7]發(fā)現(xiàn)大黃素型蒽醌類成分、二蒽酮及蒽酮糖苷類成分可選擇性抑制UGT1A1酶的活性，使膽紅素代謝出現(xiàn)障礙，在肝細(xì)胞和血液內(nèi)蓄積，引發(fā)毒性。另有研究提示[8]，何首烏中的鞣質(zhì)與二苯乙烯苷類成分混合后可對肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞造成不可逆的損傷。因此，有必要開展體內(nèi)研究，對何首烏單體成分的肝損傷作用及可能機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

蒽醌類和蒽酮類是何首烏中的主要單體成分。蒽醌類成分包括大黃素、大黃酸、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚等[9]。目前有關(guān)大黃素和大黃酸的致肝毒性作用研究較為充分[10]，針對大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黃素甲醚的肝毒性研究，尤其是體內(nèi)研究則較少。此外，二蒽酮類化合物大黃素型單蒽酮在新鮮何首烏中含量較高，也有文獻(xiàn)報(bào)道其在體外的致肝毒性作用[7]。本研究擬連續(xù)14 d經(jīng)口灌胃給予SD大鼠大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚和單蒽酮，觀察動物臨床癥狀，分析體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、細(xì)胞因子水平、血清生化指標(biāo)及病理學(xué)指標(biāo)，探究3種單體成分體內(nèi)的肝毒性作用及可能的機(jī)制，為研究何首烏致肝毒性提供體內(nèi)數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠50只(給藥時(shí)約6周齡，體質(zhì)量約200 g)，購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(京)2016-0006[11]。大鼠在屏障系統(tǒng)內(nèi)PC聚碳酸酯鼠盒飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，提供鈷60放射滅菌鼠全價(jià)顆粒飼料，自由攝取。

1.2 儀器與試劑

H500FR臺式高速冷凍離心機(jī)(日本Kokusan 公司)；7180型全自動生化分析儀(日本日立公司)；PB203-N型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)；櫻花TEC5EMJ-2型自動包埋機(jī)和DRS-2000自動染色機(jī)及封片機(jī)(日本Sakura公司)；MERCK LIMTTED Luminex 200(德國Merck Millipore 公司)。

大黃素甲醚(中國食品藥品檢定研究院，批號：110758-201616，純度：99.0%)；大黃素-8-O-葡萄糖苷(源葉生物科技有限公司，純度≥98.0%)；大黃素型單蒽酮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所楊建波博士贈送，純度≥95%)；羧甲基纖維素鈉(美國Sigma Aldrich公司)；Milliplex Map Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit(德國Merck Millipore 公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥方式

動物在給藥前檢疫適應(yīng)6 d。檢疫期第6天按體質(zhì)量隨機(jī)分組法分為10組，每組5只動物。分組時(shí)動物體質(zhì)量約200 g，個(gè)體體質(zhì)量差異小于平均體質(zhì)量的±20%。給藥方式為經(jīng)口灌胃，連續(xù)給藥14 d，給藥劑量為15 mL·kg-1。

2.2 給藥劑量

何首烏的臨床每日最大用量約為每人100 g生藥，按體質(zhì)量60 kg計(jì)算，即1.7 g·kg-1。其中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷在生藥中含量以2.63 mg·g-1計(jì)，為4.5 mg·kg-1；單蒽酮和大黃素甲醚在生藥中含量以0.62 mg·g-1計(jì)，為1.05 mg·kg-1。根據(jù)大鼠與人體表面積系數(shù)(6.17)折算，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷相當(dāng)于28 mg·kg-1，以該劑量為最低劑量，分別設(shè)置28、280、1120 mg·kg-1劑量組，約為人最大擬用劑量的1倍、10倍和40倍；單蒽酮和大黃素甲醚相當(dāng)于6.5 mg·kg-1，以該劑量為最低劑量，分別設(shè)置6.5、65、650 mg·kg-1劑量組，約為人最大擬用劑量的1倍、10倍和100倍[11]。

2.3 檢測指標(biāo)

研究期間每天觀察動物臨床癥狀。給藥第1、4、8、11天及第15天解剖日麻醉前各測定1次動物體質(zhì)量。動物經(jīng)異氟烷麻醉后經(jīng)眼眶后靜脈叢采血。剖檢前一天動物禁食過夜，第15天麻醉動物后采集腹腔后大靜脈血。給藥第2、4、8、11天和第15天采血用于進(jìn)行血清生化檢測，采血量約1 mL/只。血液樣本在室溫放置1～2 h后，以4 ℃ 3500 r·min-1離心15 min，吸取血清，使用Hitachi 7180型全自動生化儀測定以下血清生化指標(biāo)：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)。給藥第2、第8天和第15天采血用于細(xì)胞因子測定，采血量約1 mL/只。血液樣本在室溫放置1～2 h后，以4 ℃ 3500 r·min-1離心15 min，取上清液，使用Luminex 200測定以下細(xì)胞因子水平：白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。

給藥結(jié)束后所有動物以CO2吸入法麻醉，腹腔后大靜脈取血完畢后，完全放血處死解剖，記錄大體病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。將動物肝臟分離后稱質(zhì)量，并使用10%甲醛固定。固定后的組織經(jīng)修塊取材后逐級75%乙醇脫水，再經(jīng)石蠟包埋，采用滑動切片機(jī)切片(厚約3 μm)。切片經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[11]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 整體毒性

實(shí)驗(yàn)期間，各組動物臨床癥狀未見與給予3種單體相關(guān)的明顯異常改變。此外，與對照組相比，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、單蒽酮、大黃素甲醚各劑量組動物在不同時(shí)期的平均體質(zhì)量(見圖1)及肝臟質(zhì)量(見表1)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，提示按照當(dāng)前的給藥方式和給藥劑量，3種單體均不會對動物整體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用。

圖1 受試物對SD大鼠體質(zhì)量的影響

給予物質(zhì)給藥劑量/mg·kg-1體質(zhì)量/kg腦質(zhì)量/g肝臟質(zhì)量/g臟體質(zhì)量比/g·kg-1臟腦質(zhì)量比/g·g-10.5%羧甲基纖維素鈉264.7±27.91.893±0.12611.824±1.6940.045±0.0026.240±0.682大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷28.0262.3±20.61.941±0.07512.332±2.0250.047±0.0056.336±0.846280.0250.8±26.11.901±0.09312.454±1.7750.050±0.0036.561±0.9711 120.0238.5±28.21.907±0.07211.642±1.6780.049±0.0056.087±0.674單蒽酮6.5257.6±38.61.958±0.13512.068±2.5990.047±0.0036.123±0.96265.0260.0±27.31.920±0.07311.616±3.6530.044±0.0116.045±1.864650.0253.4±28.01.916±0.16112.245±1.3910.048±0.0036.432±0.945大黃素甲醚6.5260.3±22.71.977±0.14411.796±1.9260.045±0.0055.951±0.77965.0264.8±35.51.955±0.12212.504±3.0900.047±0.0056.341±1.157650.0257.1±29.71.983±0.08313.096±1.6900.051±0.0076.595±0.726

3.2 血清生化檢測

實(shí)驗(yàn)期間分別在給藥第2、4、8、11天和第15天采外周血5次，以動態(tài)監(jiān)測受試物對動物與肝臟功能相關(guān)的血清生化指標(biāo)的改變，詳見表2～6。大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和單蒽酮各劑量組的血清生化指標(biāo)數(shù)值在各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，提示在當(dāng)前給藥方式和給藥劑量下，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和單蒽酮未產(chǎn)生明顯的肝損傷作用。給藥后第4天，大黃素甲醚65 mg·kg-1劑量組動物TBIL的平均值與對照組相比，出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的升高(P<0.05)，提示給予大黃素甲醚可一定程度誘導(dǎo)TBIL升高。

表2 給予受試物后第2天SD大鼠與肝臟功能有關(guān)的血清生化指標(biāo)數(shù)值

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表3 給予受試物后第4天SD大鼠與肝臟功能有關(guān)的血清生化指標(biāo)數(shù)值

表4 給予受試物后第8天SD大鼠與肝臟功能有關(guān)的血清生化指標(biāo)數(shù)值

表5 給予受試物后第11天SD大鼠與肝臟功能有關(guān)的血清生化指標(biāo)數(shù)值

表6 給予受試物后第15天SD大鼠與肝臟功能有關(guān)的血清生化指標(biāo)數(shù)值

3.3 組織病理學(xué)檢查

肝臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果詳見表7。動物肝臟鏡檢大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組中1/5可見中度肝細(xì)胞變性壞死，其他組織病理學(xué)改變包括匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(見圖2)，但均缺乏劑量效應(yīng)關(guān)系，考慮與藥物作用無關(guān)。

表7 肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果

3.4 細(xì)胞因子水平

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的多功能肽，具有調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞生長及修復(fù)損傷細(xì)胞、組織等多種功能，主要包括：白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死家族、趨化因子、生長因子等。IL-6是促炎介質(zhì)，可刺激肝內(nèi)炎癥反應(yīng)[12]；IL-10是抗炎性細(xì)胞因子，可抑制肝內(nèi)炎癥介質(zhì)的合成和表達(dá)，減輕肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)[13]；TNF-α是前炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞大量表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1，使其易受細(xì)胞毒性T細(xì)胞的攻擊而大量壞死[14]；IFN-γ是炎性細(xì)胞因子，可引起肝細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[15]。4種細(xì)胞因子均在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

實(shí)驗(yàn)期間分別在給藥第2、8天和第15天采血3次動態(tài)監(jiān)測受試物對細(xì)胞因子水平的影響，詳見表8～10。給藥后第2天，與同時(shí)期對照組平均數(shù)值比較，大黃素甲醚6.5 mg·kg-1劑量組動物IL-6和TNF-α的水平出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著升高(P<0.05)；給藥后第8天，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷28、280、1120 mg·kg-1及單蒽酮650 mg·kg-1劑量組動物IL-10的水平降低(P<0.05)，大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組動物TNF-α水平升高(P<0.05)；給藥后第15天，單蒽酮65、650 mg·kg-1和大黃素甲醚6.5、65、650 mg·kg-1劑量組動物IL-10水平降低(P<0.05)，單蒽酮650 mg·kg-1劑量組動物IFN-γ的水平也顯著下降(P<0.05)。

圖2 各組大鼠肝臟鏡檢結(jié)果(HE，×200)

給予物質(zhì)給藥劑量/mg·kg-1IL-6/pg·mL-1IL-10/pg·mL-1IFN-γ/pg·mL-1TNF-α/pg·mL-10.5%羧甲基纖維素鈉5.85±8.2847.61±37.821.08±1.254.48±3.32大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷28.06.26±7.9823.30±15.431.30±2.072.78±1.05280.01.87±0.8130.30±27.330.01±0.014.01±2.551 120.09.66±5.7136.22±16.830.09±0.075.09±4.61單蒽酮6.51.46±0.9431.76±16.410.08±0.162.08±0.4565.03.00±2.6541.81±28.450.01±0.013.78±2.95650.01.73±0.9427.21±20.270.00±0.004.86±3.50大黃素甲醚6.5 17.65±10.76?63.19±13.560.11±0.1823.77±1.35?65.02.27±0.0029.26±30.310.09±0.033.97±3.60650.03.24±3.1924.21±15.500.11±0.014.17±1.63

注：與對照組相比，*P<0.05；下同。

表9 給予受試物后第8天SD大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子平均含量

表10 給予受試物后第15天SD大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子平均含量

4 討論

本研究連續(xù)14 d經(jīng)口灌胃給予SD大鼠28、280、1120 mg·kg-1的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷，6.5、65、650 mg·kg-1的單蒽酮和大黃素甲醚，未見異常臨床癥狀及動物體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量的明顯變化，提示當(dāng)前給藥劑量下3種何首烏中重要單體成分對大鼠無明顯整體毒性作用。但血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果提示大黃素甲醚可一定程度誘導(dǎo)TBIL升高，大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組動物肝臟鏡檢可見中度肝細(xì)胞變性壞死，提示大黃素甲醚可能具有一定的肝毒性作用。

此外，實(shí)驗(yàn)期間各給藥組細(xì)胞因子水平的變化也可見一些趨勢。SD大鼠連續(xù)14天給予3種單體后，抗炎性細(xì)胞因子IL-10水平均有所降低。給藥后第2天，大黃素甲醚6.5 mg·kg-1劑量組動物IL-6和TNF-α水平即顯著升高。給藥后第8天，大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組動物TNF-α水平升高。TNF-α是與肝臟損傷密切相關(guān)的炎癥因子，其水平升高提示肝損傷的發(fā)生。IL-6是促炎介質(zhì)，可刺激肝內(nèi)炎癥反應(yīng)。另外，楊博[16]用膽總管結(jié)扎術(shù)模擬膽汁淤積性肝硬化，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白印跡檢測的方法檢測出IL-6在該疾病模型中的表達(dá)量明顯上升，提示IL-6的升高與膽汁淤積有關(guān)。王濤等[17]研究發(fā)現(xiàn)，何首烏在體內(nèi)能夠影響膽汁代謝轉(zhuǎn)運(yùn)，并引起肝損傷。本研究的結(jié)果則進(jìn)一步提示，大黃素甲醚可能具有一定的肝毒性作用。給藥后第15天，單蒽酮650 mg·kg-1劑量組動物IFN-γ的水平顯著下降。IFN-γ可以通過對G1期的阻滯來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制肝細(xì)胞的增殖，也可以通過激活肝細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1通路[18]或增加細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[19]來誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。此外，IFN-γ可以抑制血管內(nèi)皮生長因子及成纖維細(xì)胞生長因子的基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制血管形成[20]?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞阻止腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，促進(jìn)腫瘤血管生長。IFN-γ可以抑制該類酶的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管的形成[21]。單蒽酮引起的IFN-γ水平下降，可能導(dǎo)致肝細(xì)胞過度增殖，刺激腫瘤血管的生成，在病理上有發(fā)展為肝癌的可能[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)何首烏重要單體成分大黃素甲醚具有潛在肝損傷作用，結(jié)論與本課題組前期的體外研究[23-24]相符，其作用機(jī)制可能與抑制膽紅素代謝酶的活性相關(guān)。大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷均為蒽醌類化合物，與大黃素、大黃酸含有相同的蒽醌母核結(jié)構(gòu)[9](見圖3)。目前已有較為充分的研究證實(shí)了大黃素和大黃酸的致肝毒性作用[10]，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)大黃素甲醚具有肝毒性作用，提示具有大黃素型蒽醌母核結(jié)構(gòu)的單體成分具有潛在的肝毒性風(fēng)險(xiǎn)。

R1R2R3R4大黃素CH3OHOHH大黃酸COOHOHHH大黃素甲醚CH3OHOCH3H大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷OHGluCH3H

圖3 蒽醌類成分結(jié)構(gòu)圖

本研究的給藥周期較短，受試物造成的肝損傷作用并不明顯。今后將開展更長給藥周期(如28 d連續(xù)給藥)的研究，并增加每組動物數(shù)，以明確其肝損傷作用特點(diǎn)。同時(shí)也可以使用代謝組學(xué)的方法，分析3種單體干預(yù)后的血漿、尿液等生物樣本，從分子水平探討其致肝損傷的作用機(jī)制，為臨床上何首烏的增效減毒提供依據(jù)[25]。除傳統(tǒng)的血清生化指標(biāo)檢測外，本研究亦分析細(xì)胞因子水平來評價(jià)受試物的肝損傷作用。給藥后第2天，大黃素甲醚給藥組動物IL-6和TNF-α水平即升高，而血清生化檢測結(jié)果卻未見肝損傷的發(fā)生。大黃素甲醚中、高劑量組AST、CK和LDH水平降低，單蒽酮中、高劑量組CK和LDH水平降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但不具有臨床意義，考慮是由于動物個(gè)體差異引起的?？梢娕c血清生化指標(biāo)檢測相比，細(xì)胞因子水平檢測可能更為靈敏，可以及早預(yù)測藥物的肝毒性作用。