固體直接進樣-氣相色譜-質(zhì)譜分析黑葉小駁骨的揮發(fā)性成分△

冀曉雯，付金娥，鐘晟哲，廖蘇奇

廣西壯族自治區(qū)藥用植物園/西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，廣西 南寧 530023

黑葉小駁骨Justiciaventricosa，異名Gendarussaventricosa和Adhatodaventricosa[1]，又名大駁骨、黑葉接骨草、大還魂、偏腫鴨嘴花等，產(chǎn)于我國南部和西南部，是廣西傳統(tǒng)瑤藥。其味苦、微澀，性平。具有活血散瘀、續(xù)筋接骨、消腫鎮(zhèn)痛之功效[2]。據(jù)《中國現(xiàn)代瑤藥》記載，黑葉小駁骨可用于治療閉合性骨折、跌打扭傷、腰椎間盤突出、腰肌勞損、坐骨神經(jīng)痛等疾病[3]?，F(xiàn)代藥理研究證明，黑葉小駁骨可減輕骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨的退變[4]，并具有抗炎鎮(zhèn)痛的功效[5]。市售某些中成藥配方中也含有該味藥，如駁骨水。目前黑葉小駁骨的基礎(chǔ)性研究薄弱，筆者未見國內(nèi)外對其揮發(fā)性成分進行報道。

氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)是一種高選擇性、高靈敏度、高效能的分析方法，尤其適合于揮發(fā)性化合物的分析[6]。固體直接進樣技術(shù)是一種新穎的樣品前處理方法，通過進樣桿(Chromato Probe)將樣品直接送入進樣器。與常規(guī)的水蒸氣蒸餾法、溶劑浸提法相比較，該方法具有樣品量小、操作簡便、無需溶劑、操作時間短和靈敏度高等優(yōu)點。目前應(yīng)用類似技術(shù)分析中藥材揮發(fā)性成分的研究較少[7-8]。本實驗采用固體直接進樣技術(shù)，通過氣相色譜質(zhì)譜法結(jié)合保留指數(shù)(科瓦茨指數(shù)，Kovats retention indices，KI)分析黑葉小駁骨的揮發(fā)性成分，為該植物在醫(yī)藥、保健領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考，為中藥材揮發(fā)性成分的研究提供一種方便、快捷的分析手段。

1 材料

1.1 藥材

供試品采自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園引種繁育圃，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園呂慧珍主任技師鑒定為爵床科駁骨草屬植物黑葉小駁骨Justiciaventricosa的地上部分。

1.2 儀器

3800/300型 GC-MS聯(lián)用儀，帶固體進樣桿組件(美國Varian公司)；電子天平(美國Sartorius公司)。

2 方法

2.1 材料處理

取一定量的黑葉小駁骨，陰干，粉碎，過40目篩，取1 mg供試品粉末于專用微型樣品瓶中，將樣品瓶小心放入固體進樣桿。

2.2 儀器工作條件

色譜條件：進樣口采用程序升溫，初始溫度40 ℃，保持3 min，然后以200 ℃·min-1升至220 ℃，保持3 min后，以10 ℃·min-1降至40 ℃。分流比為20。色譜柱為VF-5 ms石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。初始柱溫為40 ℃，保持7 min，然后以10 ℃·min-1升至150 ℃，再以5 ℃·min-1升到250 ℃，保持5 min，后以20 ℃·min-1升到280 ℃，保持5 min。載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，70 eV。GC-MS傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為200 ℃，四極桿溫度為40 ℃。質(zhì)量范圍為m/z45～500。

2.3 KI值的測定

取正構(gòu)烷烴混合對照品(美國AccuStandar公司)，稀釋后按照2.2條件分析，進樣量1 μL。記錄各正烷烴保留時間，采用線性升溫公式(1)計算藥材各組分的KI值[9]。

(1)

式中：tx、tn和tn+1分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于n和n+1之間的正烷烴(tn

3 結(jié)果與討論

3.1 總離子流圖與成分分析

按2.2條件對黑葉小駁骨進行測試，得到總離子流圖，見圖1。通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索各峰質(zhì)譜圖，選取質(zhì)譜匹配度高的前6個可能物質(zhì)，計算KI值并與NIST庫KI值檢索結(jié)果相比較，以質(zhì)譜和KI值匹配度最高的化合物為鑒定結(jié)果，采用面積歸一化法計算各組分的相對含量，見表1。

本實驗共從黑葉小駁骨揮發(fā)性化學(xué)成分中檢出29種成分，運用質(zhì)譜結(jié)合KI的定性方法鑒定了其中22種，其相對含量占總檢出物的94.46%。其中含量較高的分別為棕櫚酸(39.20%)、角鯊烯(10.25%)、硬脂酸(10.05%)、油酸(7.86%)、植醇(5.21%)、十八炔(3.52%)、肉豆蔻酸(2.77%)等。由此可見，黑葉小駁骨的揮發(fā)性成分主要由大量的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸組成。據(jù)文獻報道，棕櫚酸和油酸具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集及血栓形成的作用[10]。角鯊烯屬于三萜類化合物，具有廣泛的生物活性，如攜氧、調(diào)控膽固醇的代謝、抗氧化、抗腫瘤、解毒、抗輻射和抑制微生物生長等功效[11]。

圖1 黑葉小駁骨揮發(fā)性成分分析總離子流圖

表1 黑葉小駁骨揮發(fā)性成分分析結(jié)果

注：*表示測定值；**表示NIST譜庫檢索值(非極性DB-5柱)；—表示未檢出。

章小麗等[12]使用硅膠柱色譜法對黑葉小駁骨的乙酸乙酯提取物進行分離純化，利用GC/MS對柱色譜50∶1(石油醚/乙酸乙酯)洗脫部分進行了分析，結(jié)果顯示該部分的主要成分為棕櫚酸、硬脂酸和油酸。本實驗得到的主成分與文獻相近，但比例與文獻有一定差異，這可能與樣品的前處理方法、產(chǎn)地等因素有關(guān)。

3.2 直接進樣技術(shù)

直接進樣技術(shù)是美國瓦里安公司的專利技術(shù)，是氣相色譜進樣器的改進。它通過進樣桿直接將樣品送入進樣器。進樣桿的主體為一根直徑6 mm、長25 cm的不銹鋼管，其末端可以盛放專用的石英微型樣品瓶。進樣桿的主體進行了鈍化處理，能夠承受高溫，不會對樣品的檢測產(chǎn)生干擾。將進樣桿安置于氣相色譜儀上配套的進樣口后，調(diào)節(jié)進樣口溫度，樣品中的揮發(fā)性成分進入色譜柱，而不揮發(fā)的成分會滯留在樣品瓶中。因此，應(yīng)用該技術(shù)可以直接分析固體、液體或膠狀的樣品，免去了提取、凈化、濃縮的步驟，簡化了預(yù)處理程序。同時由于加熱過程在氦氣保護下進行，可以避免受熱過程中樣品的氧化，減少樣品損失。

3.3 KI在定性分析中的作用

中藥揮發(fā)性成分復(fù)雜且含有大量的同分異構(gòu)體，質(zhì)譜圖極其相似，通常一個色譜峰會出現(xiàn)幾個匹配度都很高的化合物與之對應(yīng)，僅采用常規(guī)譜庫檢索不易準(zhǔn)確定性。KI是一種氣相色譜定性參數(shù)，用來描述化合物在色譜柱上的保留行為。當(dāng)固定相一定時，這種行為僅與化合物的拓撲、幾何和電性特征相關(guān)。不同化合物在色譜柱上通常表現(xiàn)出不同的特征保留行為，故色譜保留指數(shù)可以作為一種輔助定性的良好手段[13]。因此，分析中藥揮發(fā)性成分時，同時考慮色譜峰的質(zhì)譜匹配度和KI相似度，可提高結(jié)果鑒定的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本實驗以固體直接進樣結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析黑葉小駁骨的揮發(fā)性成分，通過色譜峰的質(zhì)譜匹配度和KI相似度對色譜峰進行定性，用總離子流色譜峰的峰面積進行歸一化定量。實驗表明，黑葉小駁骨的揮發(fā)性成分主要由大量的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸組成，同時還含有三萜類物質(zhì)角鯊烯。這些成分也許與黑葉小駁骨活血散瘀的作用有關(guān)，其作用機理有待進一步研究。而采用固體直接進樣技術(shù)，不需要溶劑，能夠簡化實驗步驟，縮短分析時間，更真實地反映樣品情況。該技術(shù)具有較大的開發(fā)前景，其在中藥材揮發(fā)性成分分析上的應(yīng)用還有待進一步開發(fā)與完善。