壯藥山風(fēng)中的黃酮類化學(xué)成分研究△

何麗麗，姚彩云，閆炳雄，吳玲玲，劉喜慧，繆劍華，宋志軍

西南瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室/廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023

山風(fēng)為菊科艾納香屬多年生草本植物，學(xué)名馥芳香艾納Blumeaaromatica(Wall.)DC，又名香艾，為廣西民間應(yīng)用非常廣泛的草藥，《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《現(xiàn)代本草綱目》《壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》等記載，山風(fēng)味辛、微苦，性溫，氣香，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、濕疹、皮膚瘙癢；壯醫(yī)，調(diào)龍路火路，祛毒濕，止癢，用于發(fā)旺(風(fēng)濕骨痛)，能晗能累(濕疹)。山風(fēng)是廣西盈康藥業(yè)“華佗風(fēng)痛寶”系列產(chǎn)品的主要原料藥之一。山風(fēng)作為壯藥，在廣西民間有悠久的藥用歷史，但一直缺乏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，直到2008年才收錄入《壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第一卷，且只有性狀鑒定，缺乏定量的質(zhì)量控制指標(biāo)，甚至沒有最基本的薄層鑒別。此前，人們對(duì)艾納香屬植物的研究比較多的是艾納香、東風(fēng)草、假東風(fēng)草[1-2]。關(guān)于山風(fēng)化學(xué)成分的研究?jī)H有幾篇文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]，其中黃酮類化合物共有12個(gè)，還不足以說(shuō)明山風(fēng)黃酮類化合物的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步揭示山風(fēng)藥理活性的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，充分挖掘民族藥的潛力，開發(fā)其活性成分，提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)山風(fēng)的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從山風(fēng)乙酸乙酯部位中共分到了7個(gè)黃酮類化合物，通過(guò)理化常數(shù)的測(cè)定、各種光譜數(shù)據(jù)的分析，確定了它們的結(jié)構(gòu)。

1 材料與儀器

1.1 材料

由廣西盈康藥業(yè)提供的山風(fēng)全草(華佗風(fēng)痛寶的原料藥)，經(jīng)盈康藥業(yè)執(zhí)業(yè)藥師梁峰鑒定為馥芳香艾納Blumeaaromatica(Wall.)DC，其標(biāo)本(No.153603)保存在廣西壯族自治區(qū)藥用植物園標(biāo)本館。

1.2 儀器及試劑

Sephadex LH-20凝膠(Pharmacia公司)；ODS-C18反相填料(50 μm)(Silicycle，Canada)；薄層色譜(GF254)和柱色譜硅膠(160～200、200～300目，青島海洋化工廠)。實(shí)驗(yàn)中所用到的石油醚、甲醇、丙酮、三氯甲烷等溶劑均為色譜級(jí)，購(gòu)自天津富宇化工有限公司。

600兆核磁共振儀(Varian-600 MHz NMR Spectrometer，瓦里安)，液-質(zhì)聯(lián)用儀(Varian 320-MS，瓦里安)，分析型高效液相色譜儀(Varian 210，瓦里安)，制備型液相色譜儀(Preparative HPLC 218，瓦里安)，XR4顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(上海光學(xué)儀器廠)。

2 提取與分離

粉碎后的干燥藥材2 kg通過(guò)80%乙醇水提取濃縮，得到提取物(143 g)，將該提取物分散在40 ℃的熱水(含乙醇20%)中，經(jīng)石油醚萃取除脂后，以乙酸乙酯萃取得到77 g提取物。乙酸乙酯萃取部分經(jīng)MCI脫葉綠素后經(jīng)硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脫，TLC檢測(cè)合并相似部位后得到5個(gè)部分。A部分主要為低極性脂肪酸等，棄去。B部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，甲醇洗脫，再結(jié)合重結(jié)晶或硅膠Flash柱色譜分離純化，得到化合物2(12.1 mg)、4(35.0 mg)、9(5.3 mg)及10(18.2 mg)；D部分經(jīng)反相制備色譜，以甲醇-水(5%～95%)梯度洗脫，結(jié)合SephadexLH-20凝膠柱色譜純化得到化合物1(5.3 mg)和3(18.7 mg)；E部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜得到黃色的黃酮類化合物5(4.8 mg)、6(5.7 mg)、7(17.8 mg)。C部分經(jīng)TLC檢測(cè)，主要成分是前后B、D的交叉，未做進(jìn)一步分離。

3 結(jié)果

化合物1：金黃色細(xì)針狀晶，ESI-MSm/z：343 [M-H]-，345 [M+H]+提示其分子式為C18H16O7。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.56(1H，s，H-8)及12.43(1H，s，5-OH)提示A環(huán)僅有一個(gè)氫原子未被取代，δ7.03(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)和8.02(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，示有一個(gè)對(duì)稱的B環(huán)；δ4.03(3H，s)，3.86(3H，s)，3.91(3H，s)的3個(gè)孤立特征單峰提示有3個(gè)甲氧基存在。其碳譜13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：155.0(C-2)，138.4(C-3)，179.2(C-4)，152.3(C-5)，130.0(C-6)，156.1(C-7)，93.1(C-8)，151.8(C-9)，106.2(C-10)，122.8(C-1′)，130.2(C-2′，C-6′)，114.1(C-3′，C-5′)，161.7(C-4′)，60.1，59.8，55.3(3個(gè)-OCH3)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的Santin一致。

化合物2：為亮黃色固體，質(zhì)譜提示其分子量為284，ESI-MSm/z：283[M-H]-，285[M+H]+，扣除母核的222，尚余62個(gè)質(zhì)量單位，提示該化合物可能是有2個(gè)羥基取代，1個(gè)甲氧基取代的黃酮，碳譜中δ128.1及114.6峰高為其他峰的2倍，提示B環(huán)為4′位的單取代模式，δ99.3及94.2的高場(chǎng)芳碳信號(hào)提示A環(huán)是5，7-二取代模式，查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)它的13C-NMR(DMSO-d6)數(shù)據(jù)(δc)：163.8(C-2)，103.9(C-3)，182.3(C-4)，161.7(C-5)，99.3(C-6)，164.2(C-7)，94.2(C-8)，157.5(C-9)，104.6(C-10)，123.7(C-1′)，128.1(C-2′)，114.6(C-3′)，162.5(C-4′)，114.8(C-5′)，128.1(C-6′)，56.3(-OCH3)與金合歡素(acacetin)一致[7]，故鑒定該化合物為金合歡素(又名刺槐素或刺槐黃素)。

化合物3：黃色針狀晶體，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z269 [M-H]-，提示其分子量為270，其氫譜δ7.92(2H，d，J=9.0，H-2′，6′)，6.92(2H，d，J=9.0，H-3′，5′)的信號(hào)提示示它的B環(huán)具有AA′BB′模式的耦合系統(tǒng)，低場(chǎng)的δ12.96(1H，s，5-OH)羥基信號(hào)表明它有5-OH，在δ6.77的單峰為H-3信號(hào)，δ6.48(1H，d，J=1.8，H-8)，6.19(1H，d，J=1.8，H-6)顯示該化合物的A環(huán)有兩個(gè)未取代的間位氫，沒有甲氧基信號(hào)。查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)它的氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的芹菜素一致，故確定該化合物為4′，5，7-三羥基黃酮，即芹菜素(apigenin)。

化合物4：黃色粉末，ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z：361 [M+H]+和359 [M-H]-，說(shuō)明該化合物分子量為360，1H-NMR和13C-NMR譜顯示有3個(gè)甲氧基，13C-NMR譜在低場(chǎng)區(qū)的15個(gè)碳信號(hào)說(shuō)明此化合物為一個(gè)黃酮類化合物。1H-NMR譜提示其B環(huán)的3′和4′位上質(zhì)子被取代[δ6.95(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.63(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)和7.55(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)]，而A環(huán)只剩下H-8沒有被取代[δ6.56(1H，s)]，在δ12.74處的1個(gè)單峰信號(hào)，提示有1個(gè)5-OH。根據(jù)分子量，應(yīng)該還有兩個(gè)羥基，查閱文獻(xiàn)[6]，發(fā)現(xiàn)該化合物的NMR數(shù)據(jù)：1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.74(s，C5-OH)，7.63(d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.55(dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，6.95(d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.56(s，H-8)和13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：156.1(C-2)，137.8(C-3)，178.4(C-4)，152.7(C-5)，131.3(C-6)，157.5(C-7)，94.6(C-8)，152.1(C-9)，105.2(C-10)，122.8(C-1′)，116.2(C-2′)，147.8(C-3′)，150.5(C-4′)，112.5(C-5′)，121.3(C-6′)，56.2，60.1，60.2(-OCH3)與化合物3，6，4′-三甲氧基-5，7，3′-三羥基黃酮，即矢車菊黃素(centaureidin)一致。

化合物5：黃色粉末，ESI-MS在m/z：301 [M+H]+和299 [M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰說(shuō)明其分子量為300?？鄢S酮母核222的質(zhì)量數(shù)，尚余78，恰好符合黃酮類母核增加3個(gè)羥基及1個(gè)甲氧基所需的質(zhì)量數(shù)。由1H-NMR和13C-NMR特征可知該化合物也是1個(gè)黃酮類化合物，氫譜耦合常數(shù)提示該化合物的B環(huán)為1個(gè)ABX耦合系統(tǒng)，而A環(huán)5位上也有1個(gè)羥基[δ12.90(1H，s)]，δ6.22和6.52(d，J=1.8 Hz，each 1H)的1組耦合質(zhì)子表明了H-7也被取代。此外氫譜顯示還有1個(gè)甲氧基和另外2個(gè)羥基，與文獻(xiàn)[9]對(duì)照，其1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.90(C5-OH)，10.53(C7-OH)，9.98(C4′-OH)，7.56(2H，m，H-2′，H-6′)，6.96(1H，d，J=8.4，H-5′)，6.22和6.52(d，J=1.8 Hz，each 1H，H-6及H-8)和13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：164.2(C-2)，103.4(C-3)，182.1(C-4)，157.6(C-5)，99.4(C-6)，164.1(C-7)，94.9(C-8)，161.8(C-9)，104.5(C-10)，122.5(C-1′)，110.2(C-2′)，151.1(C-3′)，148.6(C-4′)，116.1(C-5′)，120.5(C-6′)，56.2(-OCH3)與3′-甲氧基-5，7，4′-三羥基黃酮一致，故該化合物鑒定為3′-甲氧基-5，7，4′-三羥基黃酮，即金圣草黃素或柯伊利素(chrysoeriol)。

化合物6：黃色粉末，在254 nm的紫外燈照射下有深色熒光，TLC展開后噴硫酸-香草醛加熱顯黃色斑點(diǎn)。ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z：285 [M-H]-和571 [2M-H]-，推測(cè)其分子量為286。1H-NMR譜在δ9～13顯示出4個(gè)活潑羥基質(zhì)子信號(hào)。分別為12.85(1H，s)、10.58(1H，brs)、9.81(1H，brs)和9.51(1H，brs)。13C-NMR譜在δ94～183顯示有黃酮骨架的15個(gè)碳信號(hào)峰，故推測(cè)該化合物應(yīng)該為1個(gè)黃酮類化合物，與文獻(xiàn)對(duì)照，其1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.18(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，6.38(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.61(1H，s，H-3)，6.77(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.35(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.42(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)及12.85(1H，s)、10.58(1H，brs)、9.81(1H，brs)和9.51(1H，brs)4個(gè)羥基信號(hào)和13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：164.3(C-2)，103.4(C-3)，182.1(C-4)，161.7(C-5)，99.3(C-6)，164.5(C-7)，94.3(C-8)，157.9(C-9)，104.0(C-10)，122.4(C-1′)，113.9(C-2′)，146.4(C-3′)，150.6(C-4′)，116.5(C-5′)，119.7(C-6′)與木犀草素的基本一致[10]，故鑒定該化合物為木犀草素(luteolin)。

化合物7：黃色無(wú)定型粉末。ESI-MSm/z：433[M-H]-，提示其分子量為434。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.72(1H，s，H-3)，6.43(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，7.38(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.91(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.43(1H，dd，J=1.8，8.4 Hz，H-6′)，5.03(1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，3.20～3.50(6H，m，H-2″～H-5″)。以上數(shù)據(jù)及13C-NMR(DMSO-d6)數(shù)據(jù)(δC)：164.3(C-2)，103.4(C-3)，182.2(C-4)，156.9(C-5)，99.5(C-6)，163.2(C-7)，94.2(C-8)，160.6(C-9)，105.9(C-10)，121.8(C-1′)，114.9(C-2′)，144.9(C-3′)，150.6(C-4′)，115.5(C-5′)，119.3(C-6′)，99.79(C-1″)，73.3(C-2″)，76.4(C-3″)，69.6(C-4″)，77.5(C-5″)，61.2(C-6″)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷一致，與木犀草苷對(duì)照品在正反向薄層板上具有相同的Rf值斑點(diǎn)，故鑒定該化合物為木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)

4 結(jié)論

黃酮類化合物在藥用植物中普遍存在，是活性非常廣泛的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗癌、延緩衰老、消炎殺菌等功效。本研究從壯藥山風(fēng)中提取分離得到7個(gè)黃酮化合物，除了木犀草素[3-4](文獻(xiàn)糾正：藍(lán)鳴生等于2012年報(bào)道的山風(fēng)中的7，3，-二甲基蘆丁有誤，從核磁共振數(shù)據(jù)及英文名“l(fā)uteolin-7，3-dimethyl ether”可以看出該化合物當(dāng)為7，3，-二甲氧基木犀草素[5])，其余化合物均為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這些化合物具有很好的藥理活性。如化合物1具有抗炎、抗病毒[12-13]及黃嘌呤氧化酶的抑制活性[14]，這也許可以詮釋該藥治療痛風(fēng)及風(fēng)濕病的機(jī)理；金合歡素(2)、芹菜素(3)具有抗癌及抗氧化活性[15-18]；矢車菊黃素(4)具有很強(qiáng)的免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用，可抑制黑色素從生黑素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移，具有舒張血管的活性[19-20]；金圣草黃素(5)除了具有抗炎、抗感染活性，也可能是胰腺癌等腫瘤治療的先導(dǎo)化合物[21-23]，是一種選擇性的PI3K-AKT-mTOR通路抑制劑[23-24]；木犀草素(6)除了具有抗炎、抗感染活性，還可以抑制環(huán)腺苷-磷酸二酯酶活性，可能是山風(fēng)治療痛風(fēng)及風(fēng)濕病的活性物質(zhì)基礎(chǔ)之一[22，25]；木犀草苷(7)具有抗感染、治療骨質(zhì)增生的活性[26-27]。這些化學(xué)成分的分離鑒定為山風(fēng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)山風(fēng)的藥效機(jī)理研究有重要的意義。