太子參葉斑病生防小球的制備工藝及對太子參品質(zhì)的影響

郭丹釗　葛璐　馬海樂　李振江　韓邦興

摘要：以生防小球的機械性能及傳質(zhì)性能為指標，優(yōu)化太子參葉斑病生防小球的制備工藝，并研究環(huán)境條件對生防小球拮抗性能的影響。結(jié)果表明，當聚乙烯醇濃度為9%，海藻酸鈉濃度為3%，活性炭濃度為2%時，生防小球的機械性能、傳質(zhì)性能最佳;芽孢包埋濃度為108 CFU/mL時，生防小球的拮抗性能最強。大田試驗中施用生防小球后，太子參的水分含量無明顯變化，多糖含量明顯增加，灰分含量增加，皂苷含量減少。

關(guān)鍵詞：太子參;葉斑病;固定化微生物;多糖;皂苷;制備工藝;拮抗活性;生物防治

中圖分類號： S435.675文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0163-04

太子參為石竹科孩兒參[Pseudostellariae heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]的干燥塊根，是國家衛(wèi)生健康委員會公布的可用于保健的補益中成藥[1]。富含糖類、環(huán)肽類、氨基酸類、皂苷類、磷脂等多種成分，具有心機保護、止咳、抗應激、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種功能[2-3]。近年來，葉斑病等真菌病害嚴重影響了太子參的生長，造成其產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降[4-5]。太子參葉斑病病原菌的分生孢子器可以在病殘體上越夏和越冬，翌年條件適宜時分生孢子器釋放出分生孢子進行初侵染，發(fā)病后產(chǎn)生分生孢子進行再侵染。農(nóng)業(yè)防治和化學防治是目前太子參葉斑病的主要防治措施，而生物防治法可緩解常規(guī)化學防治帶來的環(huán)境污染、抗藥性等問題，是太子參栽培過程中藥物防治的重要補充[5-8]。

固定化微生物技術(shù)具有生物濃度易控制、耐毒害能力強、產(chǎn)物易分離、菌種流失少等優(yōu)點[9]，目前主要應用于工業(yè)生產(chǎn)[10-11]和廢水處理[12-14]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也開展了部分研究，并顯示出良好的應用前景[15-16]。常見的用于固定化微生物的材料有天然有機聚合物、化學合成聚合物及無機載體材料等，而利用有機聚合物對傳統(tǒng)無機載體材料進行改性，制備兼具兩者優(yōu)良特性的復合載體用于微生物的固定化研究，受到了眾多學者的青睞[17]。筆者所在課題組在前期研究過程中篩選獲得1株太子參葉斑病的高效拮抗菌JK05菌株，盆栽試驗和大田試驗均呈現(xiàn)出顯著的生防效果[18]，本試驗旨在采用聚乙烯醇-海藻酸鈉-活性炭復合材料制備拮抗菌JK05生防小球，并對其制備工藝進行優(yōu)化，同時考察生防小球的施用對太子參品質(zhì)的影響，以期為將其應用于太子參栽培土壤并抑制土壤中太子參葉斑病病原菌活性奠定研究基礎，這對于降低太子參葉斑病病原菌的初侵染概率具有重要的意義，是太子參葉斑病生物防治的重要環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

拮抗菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JK05菌株，保存于江蘇大學食品與生物工程學院;病原菌為斑點葉點霉（Phyllosticta commonsii），保存于江蘇大學食品與生物工程學院。太子參為宣參1號，由安徽省宣城市金泉生態(tài)科技示范園提供。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：3 g牛肉浸膏，10 g魚粉蛋白胨，5 g氯化鈉，1 000 mL蒸餾水;牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：3 g 牛肉浸膏，10 g魚粉蛋白胨，5 g氯化鈉，1 000 mL蒸餾水，加入2%瓊脂;PDA固體培養(yǎng)基：200 g去皮馬鈴薯，1 000 mL蒸餾水，煮沸，過濾，加入2%瓊脂。各培養(yǎng)基均于121 ℃高溫滅菌20 min，備用。

1.2 主要試劑與儀器

聚乙烯醇1 750±50（PVA）、海藻酸鈉（SA）、活性炭（C）、硼酸、無水氯化鈣（CaCl2）、亞甲基藍、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鉀、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、齊墩果酸、香蘭素、冰醋酸、高氯酸等，以上試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

79-1磁力加熱攪拌器，購自江蘇省金壇市中大儀器廠;HEV-50自動高壓滅菌器，購自日本Hirayama公司;HYL-C2組合式搖床，購自江蘇省太倉市強樂實驗設備有限公司;紫外/可見分光光度計，購自北京瑞利分析儀器有限公司;DHP-9272型恒溫培養(yǎng)箱，購自上海一恒科技有限公司;臺式高速冷凍離心機，購自湘儀離心機儀器有限公司;電子分析天平E124S，購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 生防小球制備工藝的優(yōu)化

1.3.1 載體材料濃度的優(yōu)化

采用PVA、SA、C等3種固定化載體材料進行單因素試驗，PVA濃度分別設置為6%、8%、10%、12%（此時SA濃度為2%，C濃度為1%）;SA濃度分別設置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%（此時PVA濃度為10%，C濃度為1%）;C濃度分別設置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（此時PVA濃度為10%，SA濃度為2.5%）。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設置正交試驗的因素和水平，進行3因素3水平正交試驗分析，各因素水平如表1所示。

根據(jù)以上單因素和正交試驗設置的濃度，將稱取好的各載體材料加入蒸餾水中，并在磁力加熱攪拌器上進行溶解，待混合物完全溶解并攪拌均勻后，于121 ℃高溫滅菌20 min，冷卻后加入等體積的無菌水，攪拌均勻，然后用一次性無菌注射器將其滴加到含2% CaCl2的飽和硼酸溶液中，邊滴邊搖，形成的凝膠顆粒于4 ℃冰箱中固定24 h后得到固定化小球，將固定化小球取出后用無菌水沖洗3次并用濾紙吸干，分別檢測其機械性能和傳質(zhì)性能。

1.3.2 拮抗菌JK05菌株芽孢最佳包埋濃度的優(yōu)化

拮抗菌JK05菌株芽孢懸液的制備：將冰箱保存的拮抗菌JK05斜面轉(zhuǎn)接至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，在37 ℃進行活化;將活化后的菌株JK05接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h獲得種子液;將種子液接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，于37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24～36 h至菌體形成芽孢，將發(fā)酵液于4 ℃、5 000 r/min 條件下離心，取沉淀加入適量無菌水分別配制成不同濃度的芽孢懸液，備用。

生防小球的制備：采用優(yōu)化獲得的各載體材料濃度，將稱取好的各載體材料加入蒸餾水中，并在磁力加熱攪拌器上進行溶解，待混合物完全溶解并攪拌均勻后，于121 ℃高溫滅菌20 min，冷卻后加入等體積的各濃度芽孢懸液（芽孢終濃度分別為105、106、107、108、109 CFU/mL），攪拌均勻，用一次性無菌注射器將其滴加到含2% CaCl2的飽和硼酸溶液中，移入 4 ℃ 冰箱中固定24 h后得到生防小球，將生防小球取出后用無菌水沖洗3次并用濾紙吸干，以其拮抗活性為指標篩選出最佳包埋芽孢濃度。

1.4 機械性能的測定

參照文獻[19]中的方法，在鐵架臺上用細線懸掛1個質(zhì)量合適的砝碼，在砝碼的正下方放置電子秤，在電子秤上放置1個載玻片，選取1顆大小適宜的小球放置在載玻片上，使砝碼緩緩下降，使生防小球發(fā)生形變，直至小球壓縮至原直徑的1/2左右，記下此時電子秤的讀數(shù)，即為該小球的機械強度，做10次平行試驗。

1.5 傳質(zhì)性能的測定

參照文獻[20]中的方法，隨機選取50個大小均勻的生防小球放入亞甲基藍溶液中，于15 ℃、50 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)4 h后，在665 nm波長下分別測定生防小球的亞甲基藍溶液和原亞甲基藍溶液的吸光度，計算傳質(zhì)率：

傳質(zhì)率=（D空白-D樣品）/D空白×100%。

式中：D空白為空白溶液的吸光度;D樣品為樣品溶液的吸光度。

1.6 拮抗活性的測定

采用對峙培養(yǎng)法測定拮抗活性[21]，病原菌斑點葉點霉經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化后，用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，接種至PDA平板培養(yǎng)基的中央，菌餅正面朝下放置，并用接種鏟輕壓菌餅使其緊密貼合于培養(yǎng)基表面，取生防小球在無菌條件下置于距平板中央菌餅2.5 cm處，將完成接種的平板放置于27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，同時以不接生防小球的平板作為對照，計算出生防小球的抑菌率，通過抑菌率判斷拮抗活性，培養(yǎng)基示意如圖1所示。

抑菌率=（d空白-d處理）/d空白×100%。

式中：d空白為對照平板的病原菌菌落直徑;d處理為放置生防小球方向菌落直徑（圖1）。

1.7 生防小球?qū)μ訁⑵焚|(zhì)的影響

1.7.1 生防小球的大田試驗

根據(jù)最優(yōu)載體材料濃度和最佳包埋芽孢濃度制備生防小球，用于大田試驗，試驗在安徽省宣城市金泉生態(tài)科技示范園中進行，太子參品種為宣參1號，選擇芽頭完整、參體肥大的種參塊根，在10月中旬種植，在畦面上按行距12～15 cm橫向開溝，保持溝深12～13 cm，按株距5～7 cm芽頭向上、同方向、稍傾斜地栽入溝內(nèi)，距離地面6 cm。然后將生防小球按0.1、1.0、10.0 g/株3種試驗劑量均勻置于塊根周圍土壤，覆細土壓實、澆水，并設置對照組不添加生防小球，其他操作與試驗組一致。正常水肥管理至次年6月份，當參苗枯萎后及時采收，去除莖葉，洗凈并晾干表面水分，用于太子參品質(zhì)測定。

1.7.2 水分含量測定

將太子參置于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，按以下公式計算其水分含量：

水分含量=（m1-m2）/m2×100%。

式中：m1為太子參鮮質(zhì)量，g;m2為太子參干質(zhì)量，g。

1.7.3 多糖的提取與含量測定

將烘干的太子參研磨成粉末，稱取0.1 g粉末至試管中，加入10 mL 80%乙醇浸泡過夜，于5 000 r/min離心10 min，取沉淀按照1 g ∶20 mL（干粉 ∶蒸餾水）的比例加入蒸餾水，于90 ℃恒溫水浴中浸提 3 h，于5 000 r/min離心10 min，重復提取3次，合并上清液。按1 ∶2（上清液 ∶95%乙醇）的體積比向上清液中加入95%乙醇，在4 ℃冰箱中過夜后于5 000 r/min離心10 min，取沉淀用蒸餾水定容至10 mL，稀釋20倍，得到太子參粗多糖溶液。采用苯酚-硫酸法[22]測定太子參多糖含量。

1.7.4 皂苷的提取與含量測定

稱取0.1 g太子參粉末置于50 mL離心管中，加入10 mL無水乙醇，于75 ℃恒溫水浴中浸提2 h，取出冷卻至室溫，于5 000 r/min離心10 min，收集上清液即為太子參皂苷溶液。采用香草醛-冰醋酸法[23]測定太子參皂苷含量。

1.7.5 灰分含量測定

采用干法灰化法[24]測定灰分含量。取坩堝置于高溫爐內(nèi)，將蓋子斜蓋在坩堝上，經(jīng)550 ℃熾灼約1.5 h，取出坩堝，稍冷片刻移置干燥器內(nèi)并蓋上蓋子，放冷至室溫，精密稱定坩堝質(zhì)量并記錄，重復數(shù)次，直至恒質(zhì)量。稱取1.0 g樣品，置已熾灼至恒質(zhì)量的坩堝內(nèi)，將盛有供試品的坩堝置于通風柜內(nèi)的電爐上緩緩灼燒，樣品全部炭化呈黑色，并不冒濃煙。然后將坩堝移置高溫爐內(nèi)，蓋子斜蓋于坩堝上，在550 ℃熾灼4 h，使樣品完全灰化，重復數(shù)次，直至恒質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防小球制備工藝的優(yōu)化

2.1.1 載體材料濃度的優(yōu)化

單因素試驗考察固定化小球載體材料濃度對其機械性能及傳質(zhì)性能的影響。由圖2可以看出，在供試濃度范圍內(nèi)，隨著PVA濃度的增加，生防小球的機械性能不斷增強，而其傳質(zhì)性能逐漸降低。設置了SA的濃度范圍為1.0%～3.5%，隨著SA濃度的增加，生防小球的機械性能逐漸增強，傳質(zhì)性能則先增強后減弱，在SA濃度為2.5%時，生防小球的傳質(zhì)性能達到最強。在濃度為0.5%～3.0%范圍內(nèi)，隨著C濃度的增加，生防小球的機械性能無明顯變化，傳質(zhì)性能則同樣先增強后減弱，在C濃度為2.0%時傳質(zhì)性能達到最強。

總體來看，PVA濃度為8%～10%、SA濃度為2.0%～3.0%、C濃度為1.0%～2.0%時，制備的生防小球機械性能與傳質(zhì)性能均較良好，因此，選擇PVA濃度為8%、9%、10%，SA濃度為2.0%、2.5%、3.0%，C濃度為1.0%、1.5%、2.0%，進行下一步的正交試驗。

正交試驗共有9組，將機械性能和傳質(zhì)性能2個指標轉(zhuǎn)換成相應的隸屬度，用隸屬度和其權(quán)重來計算總評分，隸屬度計算方法如下：

指標隸屬度=（指標值-最小指標值）/（最大指標值-最小指標值）。

根據(jù)實際要求，機械性能的權(quán)重定為1，傳質(zhì)強度的權(quán)重定為1，計算并獲得各指標分數(shù)的加權(quán)和作為總評分?？傇u分=1×機械性能隸屬度+1×傳質(zhì)強度隸屬度。由表2可知，RB>RC>RA，各因素的主次順序表現(xiàn)為B>C>A。由于A因素中k2>k3>k1，B因素中k3>k2>k1，C因素中k3>k2>k1，因此，最優(yōu)方案為A2B3C3，即各載體材料的最佳配比為9% PVA，3% SA，2% C。

2.1.2 拮抗菌JK05芽孢最佳包埋濃度的優(yōu)化

考察拮抗菌JK05芽孢的不同包埋濃度對生防小球拮抗活性的影響。由圖3可以看出，隨著芽孢包埋濃度的增大，生防小球的拮抗活性逐漸增強，當濃度為108 CFU/mL時，生防小球的抑菌率達到最大值，為44.64%。

2.2 生防小球?qū)μ訁⑵焚|(zhì)的影響

在太子參栽培過程中，向栽培土壤中施用不同劑量的生防小球，各處理組太子參水分、多糖、皂苷、灰分含量等的測定結(jié)果如圖4所示。多糖和皂苷是太子參主要的生物活性成分，具有抗疲勞、抗應激和增強機體免疫功能等重要藥理作用。由圖4可以看出，施用生防小球后，太子參的水分含量無明顯變化，多糖含量有明顯的增加，皂苷含量有所降低，灰分含量有所增加，表明太子參栽培過程中施用生防小球，可明顯提高參體的多糖含量，這可能是由于生防小球中拮抗菌對太子參根周環(huán)境有抑菌促生作用，改善了根周環(huán)境，從而促進太子參的生長發(fā)育及生物活性物質(zhì)的積累。

3 結(jié)論

經(jīng)單因素和正交試驗分析，獲得太子參葉斑病生防小球的最佳制備工藝為9% PVA，3% SA，2% C，拮抗菌JK05菌株的芽孢最佳包埋濃度為108 CFU/mL。太子參大田栽培結(jié)果顯示，施用太子參葉斑病生防小球后，收獲的太子參水分含量無明顯變化，多糖含量明顯增加，皂苷含量減少，灰分含量增加，即太子參葉斑病生防小球的施用對太子參部分重要活性成分的積累具有一定的促進作用。

參考文獻：

[1]褚書豪，汪小彩，馮 良. 太子參化學成分及其藥理作用研究進展[J]. 光明中醫(yī)，2016，31（7）：1047-1048.

[2]李傳厚，王 瑞. 太子參化學成分的研究進展[J]. 山東醫(yī)學高等?？茖W校學報，2017，39（3）：229-231.

[3]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部[M]. 2010年版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：62.

[4]張國輝，范成明，佀勝利. 2株枯草芽孢桿菌對太子參4種病原真菌的抑菌效果研究[J]. 中國植保導刊，2017，37（3）：18-23.

[5]張國輝，王 龍，任永權(quán)，等. 貴州省黔東南州太子參立枯病的病害分析及生防初探[J]. 中國農(nóng)學通報，2015，31（11）：205-209.

[6]黃 曦，許蘭蘭，黃榮韶，等. 枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進展[J]. 生物技術(shù)通報，2010（1）：24-29.

[7]周思彤. 生防菌及相關(guān)生物技術(shù)在植物病害防治中的應用[J]. 科技經(jīng)濟導刊，2017（4）：151.

[8]張禮生，陳紅印. 生物防治作用物研發(fā)與應用的進展[J]. 中國生物防治學報，2014，30（5）：581-586.

[9]沈耀良，黃 勇，趙 丹，等. 環(huán)境工程新技術(shù)叢書：固定化微生物污水處理技術(shù)[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2002.

[10]李超敏，魏永義. 固定化細胞技術(shù)應用于國內(nèi)醬油生產(chǎn)的研究進展[J]. 中國調(diào)味品，2013，38（10）：10-12.

[11]Furuya T，Kino K. Regioselective synthesis of piceatannol from resveratrol：catalysis by two-component flavin-dependent monooxygenase HpaBC in whole cells[J]. Tetrahedron Letters，2014，55（17）：2853-2855.[LM]

[12]Godjevargova T，Ivanova D，Alexieva Z，et al. Biodegradation of toxic organic components from industrial phenol production waste waters by free and immobilized Trichosporon cutaneum R57[J]. Process Biochemistry，2003，38（6）：915-920.

[13]Lebeau T，Bagot D，Jézéquel K，et al. Cadmium biosorption by free and immobilised microorganisms cultivated in a liquid soil extract medium：effects of Cd，pH and techniques of culture[J]. Science of the Total Environment，2002，291（1）：73-83.

[14]任宏洋，馬伶俐，王 兵，等. 生物炭基固定化菌劑對石油類污染物的高效降解[J]. 環(huán)境工程學報，2017，11（11）：6177-6183.

[15]胡小加，江木蘭，張銀波. 固定化植物促生菌的存活性研究[J]. 中國油料作物學報，2004，26（3）：55-57.

[16]Blackburn N T，Seech A G，Trevors J T . Survival and transport of lac-lux marked Pseudomonas fluorescens strain in uncontaminated and chemically contaminated soils[J]. Systematic and Applied Microbiology，1995，17（4）：574-580.

[17]張桂芝，廖 強，王永忠. 微生物固定化載體材料研究進展[J]. 材料導報，2011，25（17）：105-109.

[18]郭丹釗，韓邦興，顧凱華，等. 一種枯草芽孢桿菌及其在抗太子參葉斑病中的應：CN201510071402.5[P]. 2015-02-11.

[19]郭 玲，黃建華. 淺談固定化細胞顆粒的機械強度[J]. 生物學教學，2014，39（10）：49-50.

[20]李 婧. 以玉米秸稈吸附-包埋-交聯(lián)的復合固定化方法固定微生物處理芘的研究[D]. 廣州：華南理工大學，2012.

[21]歐陽慧. 生防菌株JY-1對幾種植物病原真菌和細菌的抑制作用[C]//中國植物病理學會2017年學術(shù)年會論文集，2017.

[22]池曉峰. 校正曲線法測定太子參中多糖的含量[J]. 海峽藥學，2009，21（7）：102-103.

[23]彭愛紅，熊何健，顏宇航. 太子參總皂苷的含量測定方法研究[J]. 四川師范大學學報（自然科學版），2006，29（6）：743-746.

[24]張達正，劉 強，曹志強. 測定人參水分、總灰分、酸不溶性灰分含量的不確定度評估[J]. 人參研究，2007，19（2）：15-17.