支原體肺炎患兒外周血Th17，Treg細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子表達(dá)及CRP，PCT水平的研究*

屠昌明，田 園

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230031)

肺炎是兒科多發(fā)病，可由多種病原體感染發(fā)病，其中支原體肺炎(Mycoplasmapneumonia，MPP)近年來(lái)有明顯增高趨勢(shì)，在兒童社區(qū)獲得性肺炎中約占10%～30%[1]，是由肺炎支原體(Mycoplasma，MP)引起的下呼吸道感染性疾病[2]，患兒臨床癥狀主要表現(xiàn)為刺激性干咳。目前，支原體肺炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究提示免疫細(xì)胞Th17/Treg比例失衡可能參與了兒童支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展[3]。本研究旨在探討支原體肺炎兒童外周血Th17和Treg細(xì)胞亞群及相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化以及C-反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)在臨床療效判斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年1月～2018年8月來(lái)我院兒科就診的支原體肺炎患兒75例作為實(shí)驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒符合支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，刺激性干咳典型并且持續(xù)，ELISA方法檢測(cè)血清特異度MP-IgM≥1∶40即為MP感染陽(yáng)性。病程均在一周以?xún)?nèi)，并且排除先天性疾病、免疫系統(tǒng)疾病及其他炎癥性疾病。入選患兒男性40例，女性35例，平均年齡5.5±2.7歲。選擇同期來(lái)我院體檢的健康兒童75例作為對(duì)照組，其中男性38例，女性37例，平均年齡5.8±2.6歲。兩組對(duì)象在年齡和性別方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果具有可比性。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與兒童均知情同意。

1.2 試劑和儀器 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，采用配套試劑檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞；細(xì)胞因子檢測(cè)采用商品化ELISA試劑盒，購(gòu)自美國(guó)R&D公司；CRP檢測(cè)使用日立7600全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑；PCT檢測(cè)使用梅里埃VIDAS全自動(dòng)免疫分析儀及配套試劑。

1.3 方法 實(shí)驗(yàn)組患兒入院時(shí)空腹采集靜脈血樣本，分別檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞百分比、IL-17和IL-10表達(dá)水平、CRP和PCT，治療一周后再次空腹采集靜脈血檢測(cè)CRP和PCT。對(duì)照組兒童來(lái)院體檢時(shí)采集靜脈血樣本，分別檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞百分比、IL-17和IL-10表達(dá)水平、CRP和PCT。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)具體操作步驟參考儀器說(shuō)明書(shū)，以CD3+/CD8-/IL-17+設(shè)門(mén)，檢測(cè)外周血中Th17細(xì)胞比例；以CD4+/CD25+/Foxp3+設(shè)門(mén)，檢測(cè)外周血中Treg細(xì)胞比例。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)外周血中IL-17和IL-10的表達(dá)水平，具體操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。3 500 r/min離心10 min取上層血清分別上儀器檢測(cè)CRP和PCT。所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組外周血Th17，Treg細(xì)胞，IL-17，IL-10，CRP和PCT水平比較 見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組外周血Th17細(xì)胞百分比、IL-17的表達(dá)水平、CRP和PCT水平均高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組外周血Treg細(xì)胞的百分比和IL-10的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 外周血Th17，Treg細(xì)胞，IL-17，IL-10，CRP和PCT結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

2.2 實(shí)驗(yàn)組治療一周前后外周血CRP和PCT水平比較 見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)組治療一周后外周血CRP和PCT水平均降低，與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)組治療一周前后外周血CRP和PCT結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

3.1 近年來(lái)支原體已經(jīng)成為兒童呼吸道感染的重要病原體[5]，呈流行趨勢(shì)，并且發(fā)病呈現(xiàn)低齡化，除了引起嚴(yán)重的肺部感染，可累及多器官、多系統(tǒng)損傷，有文獻(xiàn)報(bào)道支原體肺炎兒童肺外器官受累可高達(dá)40%，以心肌炎、腦炎多見(jiàn)[6]。到目前為止，臨床對(duì)支原體肺炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為兒童感染支原體以后，病原體依靠黏附蛋白黏附于肺部上皮細(xì)胞表面受體，通過(guò)吸收宿主細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行大量繁殖，同時(shí)釋放有毒代謝產(chǎn)物改變宿主細(xì)胞表面抗原結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致患兒免疫機(jī)制發(fā)生病理性改變，特別是細(xì)胞免疫功能障礙[6-7]，嚴(yán)重危害兒童身心健康。

支原體作為細(xì)胞寄生菌，可以侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。單核-巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的抗原提呈細(xì)胞，能夠?qū)⒅гw抗原分子呈遞給未分化的Th0細(xì)胞，并刺激其活化成為T(mén)h1，Th2和Th17，Treg細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞可以合成并分泌多種細(xì)胞因子[8]。有研究表明輔助性T細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子在支原體發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用[9-11]。Th17細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL-17促進(jìn)和放大炎癥反應(yīng)，Treg細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10抑制T細(xì)胞的活化和增殖，對(duì)免疫細(xì)胞起負(fù)向調(diào)節(jié)作用[12]。在機(jī)體正常狀態(tài)下，Th17和Treg細(xì)胞相互制約，共同維持機(jī)體免疫功能的動(dòng)態(tài)平衡[12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，支原體感染發(fā)生后，患兒外周血Th17細(xì)胞增加，Treg細(xì)胞減少，Th17/Treg比例失衡，由其分泌和調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子IL-17和IL-10表達(dá)異常，這與之前的報(bào)道結(jié)果一致[13-15]，表明Th17/Treg細(xì)胞失衡以及相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)異?？赡軈⑴c了兒童支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展。前期研究結(jié)果證實(shí)Notch信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)Th17，Treg的細(xì)胞分化和細(xì)胞因子的分泌[16-17]，我們推測(cè)這可能是支原體肺炎兒童外周血Th17/Treg細(xì)胞失衡的分子機(jī)制。由于檢測(cè)儀器和試劑成本昂貴，實(shí)驗(yàn)組患兒治療后Th17/Treg細(xì)胞比例以及相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)水平均未進(jìn)行檢測(cè)，參考對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果已經(jīng)可以推斷其逐步恢復(fù)至平衡，目前為減輕患兒經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)不建議臨床將此項(xiàng)進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。

3.2 C-反應(yīng)蛋白(CRP)是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體受到病原體入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)由肝細(xì)胞合成，在感染發(fā)生后的6～8 h開(kāi)始升高，1～2天內(nèi)達(dá)到峰值，最高可達(dá)正常值的10～100倍，在感染消除后急驟下降，一周內(nèi)可恢復(fù)正常。CRP水平與組織損傷后的修復(fù)程度關(guān)系密切，不會(huì)受到性別、年齡、貧血等因素的影響。因此CRP可以用于感染的早期發(fā)現(xiàn)和療效判斷，由于其價(jià)格低廉、結(jié)果可靠，目前已經(jīng)作為入院檢查的常規(guī)指標(biāo)。降鈣素原(PCT)是由甲狀腺C細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，正常人外周血中含量低于0.05 ng/ml。文獻(xiàn)報(bào)道PCT在細(xì)菌感染性疾病中升高明顯[18]，支原體具有類(lèi)似革蘭陰性菌的內(nèi)毒素及脂多糖作用，可能是由于內(nèi)毒素和細(xì)胞因子參與抑制了PCT的分解，釋放入血以后導(dǎo)致外周血中含量升高[17]。在已知的感染檢測(cè)指標(biāo)中，PCT在外周血中出現(xiàn)最早，在感染發(fā)生6 h之內(nèi)即可明顯升高。已有研究[19-20]認(rèn)為外周血中CRP和PCT水平的變化與支原體肺炎患兒病情進(jìn)展具有一定的關(guān)系，聯(lián)合檢測(cè)患兒外周血CRP和PCT水平，對(duì)診斷支原體肺炎的靈敏度和特異度可接近58%左右。本次研究旨在討論CRP和PCT在已經(jīng)確診的支原體肺炎患兒病情觀察和療效判斷中的意義，結(jié)果顯示支原體感染發(fā)生后，患兒外周血CRP和PCT水平均明顯升高，經(jīng)過(guò)有效治療以后，外周血CRP和PCT水平均下降明顯，二者在病情觀察和療效判斷上具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，支原體肺炎患兒外周血Th17/Treg細(xì)胞比例失衡和相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)異常，可能參與了兒童支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展，這為今后臨床開(kāi)展免疫治療提供了理論基礎(chǔ)和嶄新的方向。聯(lián)合檢測(cè)外周血CRP和PCT水平在支原體肺炎患兒早期診斷，特別是在病情觀察和療效判斷上具有重要價(jià)值，值得臨床推廣應(yīng)用。