白藜蘆醇對乳腺癌易感基因FBXO10啟動子及FBXO10 mRNA表達的影響

魏志帥，陳德祥，畢玉琳，徐鑫,2

(1 濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；2 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)實驗室)

乳腺癌是目前全球女性發(fā)病率和病死率最高的癌癥類型[1～3]，其早期診斷和預(yù)防主要立足于患者的易感性研究。FBXO10是一個新確定的乳腺癌易感性基因[4, 5]，乳腺癌易感性與T細(xì)胞中FBXO10表達相關(guān)。T細(xì)胞接受外界刺激后高表達FBXO10，引發(fā)T細(xì)胞凋亡，削弱對乳腺癌腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視，從而增加機體患乳腺癌的風(fēng)險[5]。研究顯示，乳腺癌易感大鼠品系Wistar Furth(WF)胸腺T細(xì)胞中FBXO10表達明顯高于抗性品系Wistar Kyoto(Wky)，推測胸腺T細(xì)胞中FBXO10水平降低有利于T細(xì)胞增殖從而抑制乳腺癌的發(fā)生。白藜蘆醇是一種天然的存在于葡萄皮、黎蘆、花生的多酚類化合物，是一種潛在的能夠替代傳統(tǒng)化療藥物的新型抗癌藥物[6]。本文探討白藜蘆醇對T細(xì)胞FBXO10表達調(diào)控作用，旨在為白藜蘆醇治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人T細(xì)胞來源細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清和雙抗生素(青霉素和鏈霉素)購自美國Invitrogen；白藜蘆醇購自美國Sigma公司；WF 、 Wky FBXO10 啟動子報告質(zhì)粒自行構(gòu)建[5]；pRL-TK質(zhì)粒購自美國Promega公司；Invitrogen LTX試劑和實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購自Thermo Fisher Scientific。用于RNA分離提取的TRI Reagent來自Molecular Research Center。

1.2 白藜蘆醇對不同長度WF、Wky FBXO10 啟動子活性的影響檢測 在血細(xì)胞計數(shù)器板上計數(shù)處于對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸浮液，并將其接種到2個24孔板中。分別將0.5 μg長度為 4.2、3.5、1.8、0.7 kb的WF、Wky FBXO10啟動子報告質(zhì)粒加25 ng pRL-TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2個24孔板的Jurkat細(xì)胞，每個長度設(shè)6個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后24 h后，每個長度的3個復(fù)孔加入濃度為50 μmol/L的白藜蘆醇，另3個復(fù)孔不加白藜蘆醇。繼續(xù)處理4 h，然后收獲細(xì)胞，使用Biotek Synergy 2平板讀數(shù)器測量每個細(xì)胞裂解物管中的相對熒光素酶活性。

1.3 不同濃度白藜蘆醇對 4.2 kb長度 WF、Wky FBXO10 啟動子活性的影響檢測 在血細(xì)胞計數(shù)器板上計數(shù)處于對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸浮液，并將其接種到2個24孔板中。使用Invitrogen LTX試劑，將0.5 μg 長度為4.2 kb的 WF、Wky FBXO10啟動子報告質(zhì)粒加25 ng pRL-TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2個24孔板的Jurkat細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h后，細(xì)胞分為5組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別加入濃度為0、10、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇。處理4 h后收獲細(xì)胞，并使用Biotek Synergy 2平板讀數(shù)器測量每個細(xì)胞裂解物管中的相對熒光素酶活性。

1.4 不同濃度白藜蘆醇處理Jurkat細(xì)胞 FBXO10 mRNA表達檢測 在血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)處于對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞制備細(xì)胞懸浮液，將其接種到6孔板中。常規(guī)孵育12 h后，選取4孔細(xì)胞分別加入濃度為0、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用TRI Reagent提取各孔Jurkat細(xì)胞總RNA。使用Invitrogen Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶將來自每個樣品的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用作qPCR反應(yīng)模板，通過特異性引物FBXO10及內(nèi)參基因GAPDH進行擴增。反應(yīng)條件為50 ℃、2 min和95℃、10min，然后95 ℃、15 s和60 ℃、1 min，40個循環(huán)。測定循環(huán)閾值 (Ct) , 觀察mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對不同長度WF、Wky FBXO10啟動子活性的影響 白藜蘆醇能夠抑制不同長度WF、Wky FBXO10啟動子活性。見表1。

表1 白藜蘆醇處理前后不同長度WF、Wky FBXO10啟動子活性比較

注：與WF比較，*P<0.05；與Wky比較，#P<0.05。

2.2 不同濃度白藜蘆醇對4.2 kb WF、Wky FBXO10啟動子活性的影響 不同濃度白藜蘆醇對4.2 kb WF、Wky FBXO10啟動子表達具有抑制作用；隨著白藜蘆醇處理濃度的增加，4.2 kb WF、Wky FBXO10啟動子活性越來越低。見表2。

表2 不同濃度白藜蘆醇對4.2 kb WF、Wky FBXO10啟動子活性比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與10 μmol/L比較，#P<0.05；與 25 μmol/L比較，☆P<0.05；與 50 μmol/L比較，△P<0.05。

2.3 不同濃度白藜蘆醇處理Jurkat細(xì)胞FBXO10 mRNA表達 Jurkat細(xì)胞經(jīng)0、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇處理后其FBXO10 mRNA表達分別為1.00±0.15、0.83±0.10、0.66±0.06、0.51±0.03。不同濃度白藜蘆醇能夠抑制乳腺癌易感基因FBXO10 mRNA表達(P均<0.05)，并且FBXO10 mRNA表達隨白藜蘆醇處理濃度的升高而降低，具有一定的濃度依賴性(P<0.05)。

3 討論

研究顯示，乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性健康[7]，其發(fā)生與遺傳、特別是與乳腺癌易感性基因有關(guān)，其中BRCA1、BRCA2已成為國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)可的乳腺癌易感基因[8～10]。FBXO10是一種新型與乳腺癌易感相關(guān)的基因[11]，其結(jié)構(gòu)和功能異常與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有顯著的抑制作用[12]。本研究從分子角度探討白藜蘆醇對乳腺癌易感基因FBXO10的作用，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對不同長度的WF和Wky FBXO10乳腺癌易感基因啟動子具有顯著抑制作用；并且不同濃度白藜蘆醇能夠顯著抑制4.2kb WF 、Wky FBXO10乳腺癌易感基因啟動子的表達，這種效應(yīng)呈現(xiàn)濃度依賴方式；在轉(zhuǎn)錄水平通過實時定量PCR發(fā)現(xiàn)白黎蘆醇能夠抑制Jurkat細(xì)胞中FBXO10 mRNA表達，隨著白藜蘆醇作用濃度的不斷增加，其抑制Jurkat細(xì)胞中FBXO10 mRNA表達的作用也在增加，表現(xiàn)出濃度依賴性方式。

FBXO10基因編碼蛋白屬于F box蛋白家族。F box蛋白的共同點是含有一個叫做F box的結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域能和泛素連接酶復(fù)合物相互作用。F box蛋白在不同物種中數(shù)量不同，差異很大。人類保守的F box蛋白只有6種，分別是FBXW1、FBXW7、FBXL2、FBXO10、FBXO25和FBXO45。目前除FBXO10之外，以上基因及其蛋白的功能均已被人們充分研究和了解。最近有研究表明，在線蟲和人類淋巴瘤中FBXO10能夠同細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因bcl-2相互作用，并且導(dǎo)致bcl-2的降解，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。FBXO10在人類B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)生突變或者低表達，使腫瘤細(xì)胞逃脫死亡，實現(xiàn)惡性增殖。目前，白藜蘆醇對乳腺癌易感基因FBXO10的調(diào)控機制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，佛波醇酯(TPA)可以激活蛋白激酶C(PKC)，后者在體內(nèi)代謝、基因表達、細(xì)胞分化增殖中起重要作用。PKC還可以磷酸化即時早期基因如c-fos和AP1 / jun的反式作用因子，并加速早期基因的表達。作為基因表達的活化蛋白，AP1能夠跨核膜傳遞信息，促進多種基因的表達。FBXO10表達升高可能與PKC活性升高及AP1跨核膜傳遞信息等作用有關(guān)[13]。因此，推斷白藜蘆醇可能通過NRF2拮抗TPA誘導(dǎo)的AP1途徑調(diào)節(jié)T細(xì)胞中FBXO10的表達，最終影響乳腺癌易感性。因此，下一步的研究方向?qū)⑹巧钊胩接懓邹继J醇對乳腺癌易感基因FBXO10的調(diào)控機制，為乳腺癌的早期預(yù)防和診斷提供理論依據(jù)。