川芎嗪對腎缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

劉文

(山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033)

腎缺血再灌注損傷(RIRI)是指各種原因?qū)е履I臟缺血后，恢復(fù)血液供應(yīng)再灌注對腎臟造成的損傷。RIRI病理機(jī)制復(fù)雜，主要與自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)[1]。川芎嗪是一種從中藥川穹中提取的活性生物堿，多年來我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)一直用于心腦疾病的治療[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，川芎嗪具有改善血液流變性、微循環(huán)、抗氧化、抗纖維化和拮抗鈣離子等藥理作用，臨床上已廣泛應(yīng)用于急慢性腎小球腎炎、急慢性腎衰竭、糖尿病腎病、腎病綜合征的治療[3,4]。2018年1月～2019年2月，本研究制備大鼠RIRI模型，觀察川芎嗪對RIRI大鼠腎功能的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量180～200 g，8周齡，飼養(yǎng)于清潔、通風(fēng)良好的環(huán)境中，自由飲食飲水，12 h晝夜節(jié)律，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自基因科技(上海)有限公司；TRIzol購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit(Perfect Real Time)購自寶生物工程有限公司；引物由山東濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司合成。RIPA、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，β-actin 一抗、NLRP3一抗、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗購自USA Protein Tech Group。Leica DM 6000 B 顯微鏡及Leica TCS SPE 共聚焦系統(tǒng)購自德國萊卡公司，Bio-Radi Cycler系統(tǒng)購買自美國Bio-Rad公司，infinite M200 PRO酶標(biāo)儀購買自澳大利亞TECAN公司，天能凝膠成像系統(tǒng)購買自中國天能公司。

1.2 動物分組及模型制備 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、RIRI組(I/R組)及川芎嗪組，各6只。RIRI模型建立[5,6]：大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。3%戊巴比妥鈉按80 mg/kg腹腔注射麻醉，背部去毛，碘伏消毒備皮。于大鼠背部脊椎旁0.5 cm、肋骨下緣0.5 cm處剪開皮膚，逐層分離肌肉，暴露腎臟，小心分離兩側(cè)腎動脈并迅速用動脈夾夾閉腎動脈，缺血45 min后松開動脈夾，恢復(fù)血流，觀察腎臟恢復(fù)情況。分兩層縫合開口，待大鼠清醒后，將其放回潔凈籠具后放回飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，定期觀察并記錄大鼠狀態(tài)及死亡情況。假手術(shù)組僅分離腎動脈，不做缺血處理。川芎嗪組再灌注恢復(fù)后立即給予鹽酸川芎嗪40 mg/kg腹腔注射，每隔6 h給藥1次，24 h后，開胸進(jìn)行PBS心臟灌流，取腎臟組織，部分組織存儲于-80 ℃環(huán)境下；部分組織用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切片。

1.3 腎組織病理變化觀察 采用過碘酸-雪夫(PAS)染色。石蠟切片脫蠟至水；1%過碘酸氧化15 min，用蒸餾水清洗；無色品紅加蓋避光染色30 min，擦凈組織旁多余染液；重亞硫酸水浸1 min，水洗2～5 min；Harris蘇木素復(fù)染2 min，水洗；1%鹽酸-乙醇分化，流水沖洗；1%氨水返藍(lán)1 min，流水沖洗；脫水，透明，樹脂封片。顯微鏡下觀察腎小管損傷情況。。

1.4 腎功能指標(biāo)檢測 心臟灌流前經(jīng)大鼠心臟取血0.5～1 mL，靜置30 min，4 ℃ 1000 g離心10 min，分離血清。采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮與肌酐。

1.5 腎細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL-DAPI雙染色法。參照TUNEL試劑盒說明書，腎組織石蠟切片脫蠟至水，加細(xì)胞通透液通透8 min，加入TUNEL反應(yīng)混合液500 μL(50 μLTdT和450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP)，DAPI染核后，封片。熒光顯微鏡下觀察，每個玻片隨機(jī)選擇10個視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。凋亡率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 腎組織中NLRP3蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取腎組織，加入RIPA(含1% PMSF)組織裂解液用組織研磨器研磨勻漿后，提取總蛋白。BCA蛋白濃度試劑盒測總蛋白的濃度，95 ℃ 10 min蛋白變性。配置10%聚丙烯酰胺凝膠，加入蛋白20 μg，用80 V電壓分離30 min，然后將電壓調(diào)至120 V分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，300 mA 90 min，室溫下5%脫脂奶粉封閉45 min，加入一抗4 ℃冰箱搖晃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。用TBST洗滌3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光液，用顯影儀曝光顯影。以β-actin作為內(nèi)參。應(yīng)用Image J分析條帶灰度值，目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7 腎組織中NLRP3 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。取適量組織或細(xì)胞，加入TRIzol 1 mL，吹打均勻后，室溫靜置15 min，加入氯仿500 μL劇烈振蕩，室溫靜置3 min，于4 ℃ 12 000 g/min離心10 min，取上清加入異丙醇250 μL輕微振蕩，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 g/min離心10 min，棄上清，75%乙醇1 mL清洗沉淀2次，4 ℃ 12 000 g/min離心10 min，加入15 μL DEPC水溶解沉淀，測濃度后，取RNA 500 ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，37 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)取cDNA 1 μL、引物1 μL、2×Taq酶10 μL，配成反應(yīng)體系20 μL，按照94 ℃變性5 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳。RT-PCR反應(yīng)取cDNA(cDNA原液1: 5稀釋)5 μL，引物 1 μL，dye 0.5 μL，2×Taq SYBR Green 10 μL，在Micro Amp Fast Optical 96-well reaction plates (AppliedBiosystems) 中進(jìn)行反應(yīng)，用SDS2.3 和RQ Manager 軟件分析結(jié)果。GAPDH作為對照基因，以2-ΔΔ法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組腎組織病理變化比較 假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，清晰可見，管腔無堵塞，無明顯組織形態(tài)異常；I/R組腎小管上皮細(xì)胞廣泛壞死，刷狀緣脫落明顯，小管呈空泡狀，腎間質(zhì)有大量中性粒細(xì)胞浸潤；川芎嗪組腎小管上皮細(xì)胞壞死較I/R組輕，腎小管刷狀緣可見少量脫落細(xì)胞，腎小管中空泡少見。

2.2 各組腎功能指標(biāo)比較 與Sham組比較，I/R組、川芎嗪組血清肌酐、尿素氮水平高(P均<0.05)；與I/R組比較，川芎嗪組血肌酐、尿素氮水平低(P均<0.05)。

表1 各組腎功能指標(biāo)比較

2.3 各組腎組織細(xì)胞凋亡率比較 Sham組、I/R組、川芎嗪組腎組織細(xì)胞凋亡率分別為(3±2)%、(60±7)%、(29±6)%。與Sham組比較，I/R組、川芎嗪組腎組織細(xì)胞凋亡率高(P均<0.05)；與I/R組比較，川芎嗪組腎組織細(xì)胞凋亡率低(P均<0.05)。

2.4 各組腎組織中NLRP3蛋白表達(dá)比較 Sham組、I/R組、川芎嗪組腎組織中NLRP3蛋白相對表達(dá)量分別為0.948±0.189、1.820±0.046、1.143±0.275。與Sham組比較，I/R組、川芎嗪組腎組織中NLRP3蛋白相對表達(dá)量高(P均<0.05)；與I/R組比較，川芎嗪組腎組織中NLRP3蛋白相對表達(dá)量低(P均<0.05)。

2.5 各組腎組織中NLRP3 mRNA表達(dá)比較 Sham組、I/R組、川芎嗪組腎組織中NLRP3 mRNA相對表達(dá)量分別為1.035±0.054、2.500±0.058、1.401±0.345。與Sham組比較，I/R組、川芎嗪組腎組織中NLRP3 mRNA相對表達(dá)量高(P均<0.05)；與I/R組比較，川芎嗪組腎組織中NLRP3 mRNA相對表達(dá)量低(P均<0.05)。

3 討論

川芎嗪具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集以及活血化瘀等作用，在心、腦、腎的缺血再灌注損傷模型中表現(xiàn)出有效的抗炎和抗氧化作用[7, 8]，但其作用機(jī)制目前尚不明確。腎缺血再灌注的病理機(jī)制主要與自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)[1]。因此本研究探討川芎嗪的作用機(jī)制與NLRP3表達(dá)及細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

本研究形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腎組織形態(tài)無異常；I/R組腎小管上皮細(xì)胞廣泛壞死，刷狀緣脫落明顯，小管呈空泡狀，腎間質(zhì)有大量中性粒細(xì)胞浸潤；川芎嗪組腎小管上皮細(xì)胞壞死較I/R組輕，腎小管刷狀緣可見少量脫落細(xì)胞，腎小管中空泡少見。且川芎嗪組血清肌酐、尿素氮血肌酐、尿素氮水平較I/R組低。說明川芎嗪能夠明顯減輕RIRI大鼠的腎損傷。細(xì)胞凋亡在RIRI中有重要作用[9]。川芎嗪治療后，RIRI大鼠腎細(xì)胞凋亡率下降，說明川芎嗪可以抑制腎細(xì)胞凋亡，從而改善RIRI。我們在后續(xù)研究中將會在體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2，以進(jìn)一步探討川芎嗪抑制NLRP3表達(dá)的深層機(jī)制。

NLRP3是NOD樣受體家族中的重要成員。當(dāng)細(xì)胞受到感染等外界刺激時，會形成由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC及pro-caspase-1組成的NLRP3炎性體。而NLRP3炎癥體激活pro-caspase-1形成caspase-1，而后者進(jìn)一步將pro-IL-18和pro-IL-1β的裂解成為有重要生物活性的炎癥因子白細(xì)胞介素18(IL-18)和IL-1β，進(jìn)而參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程[10,11]。研究表明NLRP3與心腦血管疾病、急性肺損傷、肝炎肝硬化及腎臟損傷均有關(guān)，參與腎臟缺血再灌注損傷中腎細(xì)胞的凋亡過程[12]。研究表明，炎癥反應(yīng)參與腎缺血再灌注腎臟組織損傷的整個過程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)川芎嗪治療后，腎缺血再灌注大鼠腎組織中炎癥小體NLRP3蛋白及mRNA表達(dá)均降低，提示川芎嗪非常有可能通過抑制NLRP3減輕腎缺血再灌注的腎臟損傷。

綜上所述，川芎嗪可減輕RIRI大鼠的腎損傷，改善腎功能，其作用機(jī)制可能與降低腎組織中NLRP3表達(dá)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧(ROS)參與NLRP3炎性小體的激活[10]。本研究未涉及川芎嗪對ROS的作用；且僅探討了川芎嗪對NLRP3表達(dá)的調(diào)控，未涉及NLRP3的激活。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討川芎嗪對NLRP3激活的影響；同時采用NLRP3與CD68熒光雙標(biāo)法，進(jìn)一步觀察川芎嗪對浸潤炎性細(xì)胞的作用。