氟苯尼考脅迫對(duì)土壤細(xì)菌耐藥性的影響

牛金利，彭金菊，明月月，吳 群，馬 驛

(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,廣東 湛江524088)

氟苯尼考(Florfenicol)又稱為氟甲砜霉素,是一種動(dòng)物專用的廣譜抗生素,在酰胺醇類藥物中其抗菌活性優(yōu)于氯霉素及甲砜霉素,特別對(duì)一些耐氯霉素及甲砜霉素的大腸桿菌、沙門菌、克雷伯菌仍表現(xiàn)出較高的抗菌活性。氟苯尼考被廣泛用于預(yù)防或治療家畜的細(xì)菌感染性疾病,主要用于敏感細(xì)菌所致的豬、雞及魚的細(xì)菌性疾病,尤其對(duì)呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染療效顯著[1]。近年來,由于抗菌藥的大量使用和濫用,動(dòng)物源性致病菌和環(huán)境細(xì)菌的耐藥率逐漸上升,多重耐藥現(xiàn)象也日益嚴(yán)重[2-3]。Goni[4]在對(duì)187 株沙門菌的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),有103 株具有多重耐藥性。相關(guān)研究認(rèn)為,獸用抗生素的大量使用,不僅影響環(huán)境中微生物的數(shù)量和功能,而且會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性基因并遺傳,造成環(huán)境生態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,從而使土壤、水等環(huán)境中的耐藥細(xì)菌種類和數(shù)量不斷增加[5-6]。 本試驗(yàn)通過在土壤中添加不同濃度的氟苯尼考,分離培養(yǎng)土壤細(xì)菌,采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定氟苯尼考對(duì)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的敏感性,同時(shí)采用藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定用藥前后分離的氟苯尼考敏感菌和耐藥菌對(duì)18 種抗菌藥物的敏感性,進(jìn)而了解氟苯尼考對(duì)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 土壤:采自廣東海洋大學(xué)校內(nèi)菜地10 ～20 cm 的優(yōu)質(zhì)土壤。經(jīng)檢測(cè)不含氟苯尼考。氟苯尼考:含量98%,華北制藥股份有限公司(批號(hào)13021322)。藥敏紙片:鏈霉素、阿奇霉素、多粘菌素B、頭孢氨芐、頭孢唑啉、丁胺卡那霉素、復(fù)方新諾明、利福平、多西環(huán)素、青霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、紅霉素、克林霉素、卡那霉素、苯唑西林、大觀霉素、呋喃唑酮,杭州馳成醫(yī)藥科技有限公司。培養(yǎng)基:LB 固體培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基,北京凱歐迪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 土壤處理與分組 采集的土壤過4 mm 篩,陰干后按每組2.5 kg 分裝于塑料桶內(nèi),共5 組,加入氟苯尼考使各組土壤中的藥物濃度分別為:Ⅰ組0 mg/kg、Ⅱ組0.1 mg/kg、Ⅲ組1 mg/kg、Ⅳ10 mg/kg、Ⅴ組100 mg/kg,每組3 個(gè)重復(fù)。調(diào)節(jié)土壤含水量至田間最大持水量的50%,用透氣紗布覆蓋,25 ℃±3 ℃的室溫下培養(yǎng)。

1.2.2 樣品的采集 在用藥后第14 天、28 天、56天分別從各組中采集土壤用滅菌蒸餾水進(jìn)行倍比稀釋,制備細(xì)菌懸液。具體稀釋方法:取10 g 土壤樣品于250 mL 錐形瓶中,加入90 mL 滅菌水,震蕩搖勻30 min 后取10 mL 懸浮液于另一個(gè)250 mL 的錐形瓶中,再加入90 mL 的滅菌水,以此類推,依次稀釋到適宜的濃度。

1.2.3 細(xì)菌的分離、培養(yǎng) 將上述制備好的不同濃度的細(xì)菌懸液各取0.1 mL 均勻涂布在LB 固體培養(yǎng)基上,每組涂10 個(gè)培養(yǎng)皿,28 ℃培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。每組挑取60 株乳白色、半透明、表面較光滑、邊緣整齊、易挑取的中等大小的優(yōu)勢(shì)菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 氟苯尼考對(duì)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌耐藥性的影響

1.2.4.1 土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的敏感性試驗(yàn)采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的敏感性。培養(yǎng)24 h 的土壤細(xì)菌采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù),用LB 肉湯稀釋至105CFU/mL。取滅菌的96 孔板,于每一排的各孔中加入菌液,在第1孔中加入藥液,然后依次稀釋至第11 孔,第12 孔為不加藥對(duì)照,使各排12 個(gè)孔的菌液中氟苯尼考含量分別為:256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0 μg/mL。稀釋完28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察并記錄結(jié)果,每株細(xì)菌重復(fù)3 次。

1.2.4.2 土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)其他抗菌藥物的敏感性試驗(yàn) 取30 株加藥前分離的氟苯尼考敏感菌和用藥后第56 天分離的30 株氟苯尼考耐藥菌,進(jìn)行對(duì)18 種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)。藥物的敏感性試驗(yàn)按照美國(guó)NCCLS 藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行:培養(yǎng)過夜的細(xì)菌用LB 稀釋至105CFU/mL,吸取0.1 mL 的菌液于LB 固體培養(yǎng)基上,均勻涂布,貼藥敏紙片后28 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定抑菌圈直徑。每種藥物重復(fù)3 次。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)差異顯著和Excel 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟苯尼考?xì)埩魧?duì)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌耐藥性的影響 對(duì)分離的優(yōu)勢(shì)菌鑒定結(jié)果表明,絕大多數(shù)菌株為革蘭陰性菌,菌體桿狀或彎曲狀,單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀,水解明膠、淀粉試驗(yàn)陰性,葡萄糖氧化發(fā)酵(O/F)試驗(yàn)為O(氧化產(chǎn)酸),細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)陽性,運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)陽性。結(jié)合部分細(xì)菌基因測(cè)序鑒定,培養(yǎng)分離的土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌。

氟苯尼考對(duì)細(xì)菌的MIC(最小抑菌濃度)小于或等于加藥前60%細(xì)菌的MIC 時(shí),判定該菌株對(duì)氟苯尼考敏感。氟苯尼考對(duì)分離的菌株的MIC 大于或等于加藥前60%細(xì)菌的MIC 的8 倍時(shí),判定該菌株對(duì)氟苯尼考耐藥,為耐藥菌株。

通過本試驗(yàn)可知,氟苯尼考對(duì)加藥前分離的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中60%以上的菌株的MIC=16 μg/mL,故MIC≤16 μg/mL 的菌株為敏感菌株,MIC≥128 μg/mL 的菌株為耐藥菌株。

氟苯尼考?xì)埩魧?duì)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的耐藥性作用在加藥后第14 天、28 天、56 天分見表1、表2、表3。結(jié)果表明,隨著藥物濃度的加大和藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),耐藥菌的數(shù)量逐漸增多。

表1 用藥后第14 天土壤細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用藥后14 d(表1),Ⅰ～Ⅴ組耐藥菌株數(shù)依次 為5、2、7、7、7 株,耐藥率分別為8.33%、3.33%、11.67%、11.67%、11.67%,耐藥率隨藥物濃度逐漸 升高。

表2 用藥后第28 天土壤細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用藥后28 d(表2),Ⅰ～Ⅴ組耐藥菌株數(shù)依次為5、4、9、8、14 株,耐藥率為8.33%、6.67%、15%、13.33%、23.33%,耐藥率隨藥物濃度逐漸升高。

表3 用藥后第56 天土壤細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用藥后56 d(表3),Ⅰ～Ⅴ組耐藥菌株數(shù)依次為6、7、9、15、16 株,耐藥率為10%、11.67%、15%、25%、26.67%,耐藥率隨藥物濃度逐漸升高。

表4 用藥后土壤細(xì)菌對(duì)氟苯尼考耐藥率的比較

從表4 可以看出,土壤細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的耐藥率分別為:Ⅰ組8.33% ～10%,Ⅱ組3.33% ～11.67%,Ⅲ組11.67% ～15%,Ⅳ組11.67% ～25%,Ⅴ組11.67%～26.67%。表明,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),在藥物濃度相同條件下,細(xì)菌的耐藥率逐漸升高。

2.2 土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)其他抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)

利用藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定18 種抗菌藥對(duì)用藥前分離的30 株氟苯尼考敏感菌和用藥后56 d 分離的30 株氟苯尼考耐藥菌的抑制情況。試驗(yàn)結(jié)果見表5,在供試的18 種抗菌藥中,氟苯尼考敏感菌對(duì)紅霉素、克林霉素、卡那霉素等9 種抗菌藥的敏感性顯著高于氟苯尼考耐藥菌(P ＜0.01)；氟苯尼考敏感菌對(duì)頭孢唑林、復(fù)方新諾明、多粘菌素B 的敏感性與其耐藥菌差異不顯著(P ＞0.05)；對(duì)鏈霉素、利福平等4 種抗菌藥的敏感性與其耐藥菌差異顯著(P ＜0.05)；而苯唑西林和青霉素G 對(duì)氟苯尼考敏感菌和耐藥菌無抑制作用(抑菌圈直徑為0 mm)。

3 討論

3.1 氟苯尼考?xì)埩魧?duì)土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌耐藥性的影響抗生素的大量使用和濫用而引起細(xì)菌耐藥的問題已經(jīng)引起人們的密切關(guān)注。范葶莉等[7]通過建立土壤生態(tài)模型,發(fā)現(xiàn)隨著硫酸黏菌素濃度的逐漸增大,土壤環(huán)境中的耐藥菌數(shù)量就會(huì)增加。彭金菊等[8]在池塘水中加入不同濃度的諾氟沙星,誘導(dǎo)水中的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,結(jié)果表明,誘導(dǎo)水中細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的諾氟沙星的最低濃度是8 μg/mL。馬驛等[9]研究表明,細(xì)菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率和耐藥水平隨土壤中藥物濃度的加大和時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明,土壤中添加氟苯尼考后,土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的耐藥率會(huì)隨藥物濃度的加大和作用時(shí)間的不斷推移而逐漸增多。細(xì)菌耐藥性是靠耐藥基因的水平傳播[10]還是通過質(zhì)粒進(jìn)行垂直克隆傳播[11],細(xì)菌耐藥性具體的傳播途徑如何,環(huán)境細(xì)菌的耐藥性是否能傳遞給人源或動(dòng)物源細(xì)菌,還需要更深一步的研究。

表5 抗菌藥對(duì)土壤細(xì)菌的抑制作用

3.2 土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的多重耐藥試驗(yàn) 動(dòng)物和人類病原菌的多重耐藥現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍,環(huán)境細(xì)菌的多重耐藥現(xiàn)象也越來越多。李晴等[12]研究從污水處理廠污水中分離的50 株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌陽性菌株對(duì)19 種抗菌藥物的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn),其對(duì)氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢噻肟呈100%的耐藥性；對(duì)阿莫西林、復(fù)方新諾明、氨曲南等呈一定耐藥性。楊守深等[13]檢測(cè)196 株菌對(duì)18 種抗菌藥物的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn),對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素、氨芐西林、泰樂菌素、阿奇霉素、苯唑西林和萬古霉素高度耐藥。本試驗(yàn)結(jié)果表明,18 種抗菌藥中有9 種藥物對(duì)氟苯尼考耐藥菌的敏感性都顯著低于對(duì)氟苯尼考敏感的細(xì)菌,表明對(duì)氟苯尼考耐受的細(xì)菌對(duì)其他的抗菌藥物也有耐受性,而對(duì)多粘菌素B、復(fù)方新諾明和頭孢唑啉的差異不顯著,苯唑西林和青霉素G對(duì)氟苯尼考敏感菌和耐藥菌均無抑制作用。李琳等[14]發(fā)現(xiàn)130 株分離菌中有118 株菌對(duì)三種或三種以上的抗生素顯示耐藥,且耐藥率有的高達(dá)95%以上。另外,耐藥菌的廣泛傳播是否會(huì)通過水、食物、環(huán)境污染等傳播給人類或動(dòng)物引起人們的高度重視。