苯酚硫酸法測定苗藥艾納香中多糖含量

張倩茹 凌 蕾 何芋岐 秦 琳 杜藝玫 楊夢婷 姜 媛 譚道鵬

遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州 遵義 563099

艾納香(BlumeabalsamiferaDC.) 又名大風艾、冰片艾，苗藥名檔窩凱，為菊科多年生草本植物，廣泛分布于廣西、貴州、云南、廣東等省[1]。具有祛風除濕，溫中止瀉，活血解毒的功效，作為苗藥常用于治療風寒感冒、頭風痛、風濕痹痛、寒濕瀉痢、跌撲傷痛等癥[2]。艾納香除作為民族藥直接用于臨床外，還是天然冰片——艾片(左旋龍腦)的主要提取原料[3]?；瘜W成分研究發(fā)現(xiàn)，艾納香含有揮發(fā)油類、黃酮類、倍半萜類、酚酸類等多種成分[4-8]。多糖是生物體中廣泛存在的物質，現(xiàn)今植物多糖研究日益受到關注，許多植物多糖被發(fā)現(xiàn)具有很好的生物活性，如香菇多糖能夠抗腫瘤[9-10]，人參多糖[11-12]能提高免疫力等。目前對艾納香中的多糖類成分研究較少，劉剛等[13]通過蒽酮-硫酸法及3,5-二硝基水楊酸(DNS)法對艾納香中的糖類成分含量進行了測定。本實驗采用對多糖含量測定應用更廣泛的苯酚-硫酸法對艾納香中多糖含量進行測定，以期為今后艾納香藥材全面化學成分研究及系統(tǒng)質量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 紫外-可見分光光度計(島津UV-2401PC)，DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋( 上海森信實驗儀器有限公司)；DZF-6030A 型真空干燥箱 ( 上海恒科學儀器有限公司)；BT125D 電子天平( 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；葡萄糖對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號0892-200716)；其它試劑，苯酚(分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號20140122)；硫酸(分析純，重慶川東化工(集團)有限公司，批號20140101)，水為蒸餾水。

1.2 樣品來源 艾納香藥材購自貴州苗藥生物科技有限公司，經(jīng)作者鑒定為菊科植物艾納香Blumeabalsamifera(L.) DC. 的干燥葉及嫩枝。

2 方法與結果

2.1 測定波長的選擇 分別取葡萄糖對照品溶液、供試品溶液和水各1.0 mL于量瓶中，各加5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱顯色30 min，迅速冷卻至室溫，定容，混勻，在紫外-可見分光光度計中進行波長掃描，結果顯示對照品溶液和供試品溶液在490 nm處均有最大吸收，并參考文獻[8]，確定本實驗的最佳測定波長為490 nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品25 mg，置50 mL量瓶中加水溶解，定容，搖勻，即得。

2.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.5、 1.0、 2.5、 3.0、 4.0、 5.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得濃度為0.01、0.02、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列標準溶液；分別吸取上述系列標準溶液和水1.0 mL置10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱30 min后取出，迅速冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度值。以葡萄糖標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y= 7.1971x+ 0.0174，R2= 0.9967。結果表明，葡萄糖在0.011～0.108 mg/mL范圍內具有良好的線性關系(見圖1)。

2.4 供試品中多糖含量測定 取艾納香藥材粉末0.50 g，精密稱定，加乙醚100 mL，加熱回流 0.5 h，放冷，棄去乙醚溶液，殘渣置通風櫥內揮盡乙醚后，加水 200 mL，加熱回流 2.0 h，趁熱過濾，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，定容至250 mL，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置具塞試管中，加水 1.0 mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“精密加入 5% 苯酚溶液 1.0 mL”起，依次測定吸光度，并依標準曲線方程計算出供試品溶液中葡萄糖的量，進一步根據(jù)供試品制備過程計算得到艾納香供試品藥材中多糖的含量。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取1份艾納香藥材 (批次：20171003)，按照本文“2.3”的方法操作，連續(xù)測定吸光度6次，記錄吸光度A值分別為：0.4292、0.4287、0.4290、0.4101、0.4009、0.4296，RSD值為2.98% ，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取精密度試驗用溶液，分別放置0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，記錄吸光度A值分別為：0.4292、0.4208、0.4103、0.4201、0.4109、0.4277、0.4265，RSD值為1.83%，表明樣品溶液在60 min內穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取6份艾納香藥材 (批次：20171003)，按照“2.3”的方法平行操作，分別測定吸光度，記錄吸光度A值，并計算多糖的含量分別為：2.97%、3.15%、3.01%、3.10%、2.91%、3.02%，平均含量為3.03%，RSD值為2.87%，結果表明試驗重復性良好。

2.5.4 回收率試驗 精密稱定已知含量(3.03%)的艾納香藥材 (批次：20171003) 6份，每份約0.25g，分別精密加入約7.5 mg/mL的葡萄糖標準品溶液1 mL后，水浴蒸干，按照本文“2.3”的方法平行操作，分別測定吸光度，記錄吸光度A值，并計算加樣回收率，結果表明本實驗方法回收率較好，見表1。

表1 樣品加樣回收率試驗結果

2.6 樣品測定 按“2.4”項下方法制備不同批次供試品溶液，測定其吸光度，并計算其多糖的含量，結果如表2所示。

表2 不同批次艾納香中的多糖含量

3 討論

多糖含量的測定方法主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸(DNS)法等，其中苯酚-硫酸法及蒽酮-硫酸法的原理是將多糖水解并脫水后與苯酚或蒽酮反應成有色化合物，于最大吸收波長處測吸光度；而DNS法的原理是3,5-二硝基水楊酸與還原糖反應生成棕紅色的氨基化合物，因此可以直接測定還原糖，或者經(jīng)水解后測定總糖含量。劉剛等[15]通過蒽酮-硫酸法及3,5-二硝基水楊酸(DNS)法對艾納香中的糖類成分含量進行了測定，結果顯示艾納香中的總糖含量為：14.32%～43.28%，還原糖含量為：2.73%～7.75%，多糖含量為：9.61%～34.22%，遠遠高于本文采用苯酚-硫酸法測定的結果2.19%～3.11%?？赡芘c藥材的產地、采收時間等影響因素有關，也可能是測定方法的原因。苯酚-硫酸法基本不受蛋白質的影響，且產生的有色化合物較為穩(wěn)定；蒽酮-硫酸法幾乎可以測定所有碳水化合物，但色氨酸含量較高的蛋白質對顯色反應有一定干擾，且穩(wěn)定性較差；DNS法中顯色劑易與色素等還原性物質顯色，干擾測定結果，并且水解時間要求控制嚴格。紫外分光光度法測定藥材中某一類成分易受到其它成分的干擾，準確性易受到影響。然而，對于多糖類成分由于缺少紫外吸收，無法采用高效液相法測定，因此，仍廣泛采用顯色法利用紫外分光光度計測定其含量。因此，在選擇多糖的含量測定方法時宜盡量對藥材中的化學成分類型全面研究，針對其化學成分組成選擇對多糖含量影響較小的測定方法。

目前多糖的提取工藝主要有熱水浸提法、加熱回流法、超聲提取法、微波提取法、酶提法等，本文參考《中國藥典》中藥材多糖含量的測定方法，并對加水量、回流時間、及顯色加熱時間等進行了考察，并優(yōu)選出最佳的提取及顯色條件。

多糖類成分在自然界中分布廣泛，大部分多糖都具有多種生物活性。艾納香是貴州大力發(fā)展的道地苗藥，主要用于冰片的提取，已有文獻報道艾納香還含有黃酮類、倍半萜類等多種化學成分，但很少有對艾納香中多糖類成分的報道。本文以葡萄糖為對照品，建立了苯酚-硫酸法測定艾納香中多糖含量的測定方法，為艾納香藥材資源的綜合利用提供一定的參考依據(jù)。