紅花偽品及其染色物的檢測探討

山西省晉城市食品藥品檢驗所，山西 晉城 048000

紅花始載于《開寶本草》，原名“紅藍花”[1]。中華人民共和國藥典規(guī)定其來源為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之功效[2]。主治婦女月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)閉經(jīng)，還適用于各種靜脈曲張、末梢神經(jīng)炎、跌打損傷、關(guān)節(jié)酸痛、腿腳麻木等癥。紅花為臨床常用品種，由于用途廣泛，貨源緊張，導(dǎo)致價格上漲，為賣相好看或造假，市場上摻偽染色現(xiàn)象時有發(fā)生，如有報道紅花飲片被酸性紅73、日落黃染色[3-4]，嚴重影響藥品療效，危害人類健康。近期筆者在日常工作中發(fā)現(xiàn)一種紅花的偽品，大小和顏色與紅花較為相似。為有效打擊這種違法行為，提供有力證據(jù)，本文首先從性狀入手，輔以水試，對紅花與其偽品進行了鑒別，同時發(fā)現(xiàn)可能有非法染色物存在，進而通過HPLC法對染色物質(zhì)進行了定性，并應(yīng)用HPLC-MS法對染色物質(zhì)做了進一步的確認，證實該偽品中含有胭脂紅。對染色物確證時，采用了多反應(yīng)監(jiān)測和二級全掃描相結(jié)合的模式與相應(yīng)的對照品進行比較，得出的結(jié)論更加可靠，以供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 OLYMPUS 520 照相機；OLYMPUS SZX7體式顯微鏡；Waters 2695高效液相色譜儀(2998二極管陣列檢測器，美國Waters)；Waters AcQuity uplc XEVO TQD 高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；AUW120D型電子分析天平(日本島津)；BRANSONIC 超聲波清洗機(美國BRANSON)；Medium-s300超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.2 材料 胭脂紅(批號：111771-201302)、檸檬黃(批號： 510004-201602)、金橙Ⅱ(批號：111769- 201302)、偶氮玉紅(批號：520054-201401)、酸性紅73(111773-201602)、日落黃(批號：510005-201602)等以上標準物質(zhì)均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

實驗用紅花正品藥材為2018年6月于市場收集；紅花偽品為2018年7月抽檢樣品，實驗樣品均保存于晉城市食品藥品檢驗所標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 采用OLYMPUS SZX7體式顯微鏡觀察微觀形態(tài)特征，比較紅花與其偽品的不同點，然后采用水試的方法，觀察入水前后兩者的差異以及水的顏色變化。紅花為不帶子房的管狀花，長1～2 cm，表面紅黃色或紅色?；ü谕布氶L，先端5裂，裂片呈狹條形，長5～8 mm；雄蕊5，花藥聚合成筒狀，黃白色；柱頭長圓柱形，頂端微分叉。質(zhì)柔軟。偽品與紅花正品外觀較為相似，表面橙紅色，花藥顏色為橙紅色，質(zhì)松脆。如圖1所示。

2.2 水試 取紅花及其偽品少許，分別加水25 mL，浸漬數(shù)分鐘，濾液置于比色管中，日光下檢視，紅花濾液顯淡黃色，偽品濾液顯橙紅色。將浸漬后的紅花及偽品置于白紙上，日光下觀察，紅花顏色沒有發(fā)生變化，偽品顏色退去，變成淡棕色。如圖2、3所示。

2.3 HPLC-DAD法偽品染色物質(zhì)的檢測

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters XTERRA MS C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相A(甲醇)-B(0.01 mol/L乙酸銨溶液)按表1進行梯度洗脫；柱溫30℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：508 nm；二極管陣列檢測器檢測波長范圍：200～700 nm。

2.3.2 供試品溶液制備 分別取紅花與其偽品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理 20 min，濾過，取上清液作為供試品溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備 取胭脂紅對照品適量，加甲醇制成每1 mL含胭脂紅60 μg的對照品溶液。

2.3.4 樣品測定 取紅花供試品溶液、紅花偽品供試品溶液，以及對照品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.3.5 HPLC-DAD法結(jié)果 結(jié)果表明紅花偽品供試品溶液中呈現(xiàn)與胭脂紅對照品溶液保留時間一致的色譜峰，且對照品和供試品中相應(yīng)色譜峰在200～700 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜相同。如圖3、4所示。

2.4 HPLC-MS法檢測

2.4.1 色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A(甲醇)-B(0.01 mol/L乙酸銨溶液)按表2進行梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件離子源：電噴霧ESI；電離方式：ESI+ ；電噴霧電壓：0.7KV；離子源溫度：500℃；載氣流速：1000 L/H。掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描、 二級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z 50～550，具體質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表1 HPLC-DAD 梯度洗脫條件

表2 HPLC-MS 梯度洗脫條件

表3 化合物的基本信息及MRM參數(shù)

注：二級質(zhì)譜全掃描錐孔電壓為36V，碰撞能量為30eV

2.4.2 供試品溶液制備 取紅花偽品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理 20 min，濾過，取上清液作為供試品溶液。

2.4.3 對照品溶液的制備 取胭脂紅對照品適量，加甲醇制成每1 mL含胭脂紅60 μg的對照品溶液。

2.4.4 樣品測定 取空白試劑、紅花偽品供試品溶液，對照品溶液分別稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后進樣，進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

2.4.5 HPLC-MS法結(jié)果 多反應(yīng)監(jiān)測掃描質(zhì)譜圖中，紅花偽品出現(xiàn)與胭脂紅對照試劑保留時間一致的準分子離子峰；在二級全掃描質(zhì)譜圖中，紅花偽品出現(xiàn)與胭脂紅對照試劑相同的離子碎片特征峰，進一步確證了紅花偽品供試品種中添加有胭脂紅色素(多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖詳見圖5、6)。胭脂紅的準分子離子[M-3Na+4H]+ 峰為m/z 539，其二級全掃描質(zhì)譜的特征離子碎片為 158.13、223.00、316.08。

3 討論

3.1 紅花偽品的鑒別 研究發(fā)現(xiàn)偽品紅花與正品紅花性狀差別主要體現(xiàn)在兩個方面，一是質(zhì)感，正品紅花質(zhì)地柔軟，整體性好；偽品紅花質(zhì)地則較為松脆，整體性差，易散碎。二是花藥，正品紅花的花藥顏色為黃白色，明顯比外側(cè)花瓣顏色淺；偽品紅花的花藥顏色為同外側(cè)花瓣顏色一樣為橙紅色。分析認為這種現(xiàn)象是由于偽品經(jīng)統(tǒng)一染色導(dǎo)致花瓣花藥顏色均為橙紅色，可以作為鑒別該偽品的關(guān)鍵特征?；谝陨辖Y(jié)論，本文可為基層執(zhí)法提供一種快速鑒別可疑偽品的便利方法，尤其是在沒有攜帶相關(guān)快速檢測設(shè)備的情況下，可抓住此性狀特征，對可疑品種第一時間進行控制，防止非法流通，具有一定社會效益。

3.2 染色物的檢測 采用水試法，發(fā)現(xiàn)紅花偽品入水后，褪色，懷疑其被染色，參考藥品補充檢驗方法(國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件：2013007、2014016)對方法中涉及的色素進行檢測，首先應(yīng)用薄層色譜方法對偶氮玉紅、酸性紅73、日落黃、檸檬黃、胭脂紅和金橙Ⅱ等6種染色物質(zhì)進行了初篩，并在偽品供試品中檢測到胭脂紅種染色物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻報道的方法[5]，應(yīng)用了HPLC-DAD和HPLC-MS的方法對偽品中染色物質(zhì)做了進一步的確認，證實偽品中含有胭脂紅。胭脂紅與歐盟標準禁用的蘇丹紅Ⅰ同屬于偶氮類色素，毒理學(xué)實驗顯示其有一定的致癌和突變作用，如果人在不知情的情況下長期使用了這種染色的紅花，容易引起暫時性或持久性的病理狀態(tài)，甚至危及生命，在藥品中是不允許添加的。為此，本文建立的HPLC以及HPLC-MS方法，能夠檢測紅花偽品中所摻入的胭脂紅色素，為紅花和其他藥材中非法使用胭脂紅的檢測提供參考，同時也為藥材中其他染色成分的檢測提供借鑒，為大力打擊中藥染色這種違法行為提供技術(shù)支撐，確保中藥質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效。

對紅花偽品測定的同時，對紅花正品和空白試劑也進行了考察，紅花正品溶液和空白試劑在相應(yīng)色素色譜峰位置均未出現(xiàn)干擾峰，表明本文所建立的對胭脂紅色素檢測的HPLC和HPLC-MS法專屬性良好。參考文獻[6-9]，對藥品中違法添加色素的檢測，通常最終采用液質(zhì)聯(lián)用法進行檢出物的確認，具體方法是通過與對照品的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜相比較，查看是否一致。本文采用多反應(yīng)監(jiān)測和二級全掃描相結(jié)合的模式進行測定，由于多反應(yīng)監(jiān)測可以通過對兩級離子的選擇，排除大量的干擾離子，降低了檢測背景，所以本模式可以提高檢測的靈敏度和準確度，為藥品中色素類成分的檢測提供新的思路。

綜上，通過對一種紅花偽品的鑒別，發(fā)現(xiàn)與正品紅花有明顯的性狀差異，根據(jù)此鑒別點能夠迅速進行初篩，可以用于快檢；同時經(jīng)過水試分析及現(xiàn)代分析儀器檢測，發(fā)現(xiàn)了紅花偽品中違法添加胭脂紅染色物質(zhì)，實驗結(jié)果顯示所建立的用于測定胭脂紅的HPLC以及HPLC-MS方法專屬性好，靈敏度高，可以為胭脂紅以及其他染色物質(zhì)的檢測提供參考。