結(jié)直腸癌組織中Claudin-3的表達(dá)及臨床病理意義

陳宗池 蔡清強(qiáng) 房太勇

【摘要】 目的：探討Claudin-3與結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。方法：收集筆者所在醫(yī)院2016年9月-2017年6月結(jié)直腸癌組織（32例）、結(jié)直腸腺瘤組織（25例）及正常結(jié)直腸組織（25例），采用Western blot檢測(cè)各組織中Claudin-3的表達(dá)情況。結(jié)果：Claudin-3在結(jié)腸癌組的表達(dá)水平（0.915 89±0.690 15）明顯高于結(jié)直腸腺瘤組（0.477 48±0.337 80）、正常結(jié)直腸組（0.203 15±0.218 27），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Claudin-3水平（1.296 04±0.490 18）顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（0.485 04±0.650 92），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高分化組Claudin-3水平（0.135 52±0.176 06）低于中分化組（0.881 25±0.676 63），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中分化組Claudin-3水平（0.881 25±0.676 63）也低于低分化組（1.485 91±0.375 22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而Claudin-3水平與患者年齡、性別及腫瘤大小、部位無(wú)關(guān)。結(jié)論：Claudin-3與結(jié)直腸癌的發(fā)生及分化程度、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者年齡、性別及腫瘤大小、部位無(wú)關(guān);Claudin-3有可能成為結(jié)直腸癌早期診斷的檢測(cè)指標(biāo)，并可能為臨床治療結(jié)直腸癌提供潛在的治療靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌; Claudin-3; 蛋白免疫印跡法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.001 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2019）17-000-03

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between Claudin-3 and the occurrence，invasion and metastasis of colorectal cancer.Method：Colorectal cancer tissues（32 cases），colorectal adenoma tissues（25 cases） and normal colorectal tissues（25 cases） were collected from September 2016 to June 2017.All tissues were detected by Western blot.The expression of Claudin-3.Result：The expression level of in Claudin-3 in colon cancer group（0.915 89±0.690 15） was significantly higher than that colorectal adenoma group（0.477 48±0.337 80），normal colon group（0.203 15±0.218 27），the differences were significant（P<0.05），and lymph node metastasis group（1.296 04±0.490 18） was significantly higher than the no lymph node metastasis group（0.485 04±0.650 92），the difference was significant（P<0.05），the expression level in the highly differentiated group（0.135 52±0.176 06） was lower than that in the moderately differentiated group（0.881 25±0.676 63），the difference was significant（P<0.05）.The expression level of the moderately differentiated group（0.881 25±0.676 63）was also lower than that of the poorly differentiated group（1.485 91±0.375 22），the difference was significant（P<0.05），but not related to the patients age，gender，tumor size and location.Conclusion：Claudin-3 is closely related to the occurrence and differentiation of colorectal cancer，and it is not related to the age，sex，tumor size and location of patients.Claudin-3 may be a marker for early diagnosis of colorectal cancer，and may be clinical treatment of colorectal cancer provides a potential therapeutic target.

【Key words】 Colorectal cancer; Claudin-3; Western blot

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

目前，我國(guó)結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）發(fā)病位居惡性腫瘤第4位，近年來(lái)仍有上升趨勢(shì)，且總體上的預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的研究越來(lái)越受到人們的重視。有研究證實(shí)，在癌癥的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中EMT起到了重要作用，其主要表現(xiàn)是在腫瘤邊緣細(xì)胞處破壞緊密連接結(jié)構(gòu)。緊密連接（tight junction，TJ）是相鄰細(xì)胞膜共同構(gòu)成的一個(gè)屏障。TJ與細(xì)胞的增殖、分化的調(diào)控和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。緊密連接蛋白（claudin）是TJ的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。有關(guān)于Claudin-3在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相關(guān)性研究已有報(bào)道，但是對(duì)于Claudin-3的表達(dá)與CRC發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后之間的相關(guān)性目前報(bào)道少見(jiàn)，并且尚沒(méi)有明確的定論。本研究通過(guò)檢測(cè)Claudin-3在不同病理參數(shù)的CRC組織、腺瘤組織及正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平變化。探討Claudin-3與CRC的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，為結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及了解其預(yù)后提供新途徑，繼而為臨床結(jié)直腸癌治療提供潛在的藥物治療新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年9月-2017年6月在筆者所在醫(yī)院治療的結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤患者及門診健康體檢者82例，其中結(jié)直腸癌組32例，平均年齡（60±14）歲;結(jié)直腸腺瘤組25例，平均年齡（54±11）歲;正常結(jié)直腸組25例，平均年齡（45±14）歲。所有研究對(duì)象均知情同意并由醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，所有患者術(shù)前未進(jìn)行新輔助放化療、生物治療等其他抗腫瘤治療，無(wú)合并其他惡性腫瘤、炎癥性腸病等，均有完整的臨床病理資料，組織標(biāo)本均保持完整，由兩名專業(yè)的病理科醫(yī)生進(jìn)行病理診斷確診，并行Claudin-3蛋白免疫印跡（Western blot，WB）檢測(cè)。

1.2 儀器及材料

鼠抗人Claudin-3多克隆抗體、羊抗鼠單克隆IgG抗體、GAPDH抗體、BCA蛋白定量分析試劑盒、BB5060型CO2孵箱、ECL發(fā)光掃描儀、蛋白電泳儀、蛋白核酸定量?jī)x（power PAC 2000型）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟及檢測(cè)項(xiàng)目

1.3.1 病理檢查及HE染色 取每例部分組織標(biāo)本進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片，進(jìn)行HE染色觀察各組標(biāo)本顯微鏡下的形態(tài)學(xué)改變，并區(qū)分結(jié)直腸癌組織的病理特征。

1.3.2 WB檢測(cè)各組織中Claudin-3表達(dá)水平 取剩余組織標(biāo)本-80 ℃凍存組織，進(jìn)行組織裂解，按照BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將剩余的蛋白提取液制定成蛋白樣品，再通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行抗體雜交，進(jìn)行曝光底片，多次重復(fù)后掃描照片，采集圖片信息并處理分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對(duì)于符合正態(tài)分布且方差齊的兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)于方差不齊的采用近似t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸腺瘤組、正常結(jié)直腸組的病理及HE染色

結(jié)果見(jiàn)圖1。正常結(jié)直腸組（HE×400），腺體排列規(guī)則，未見(jiàn)擁擠融合，核未見(jiàn)異性性;結(jié)直腸腺瘤組（HE×400），腺體呈管狀，排列規(guī)則，未見(jiàn)融合、背靠背現(xiàn)象、間質(zhì)浸潤(rùn)，核輕度異性，位于基底層，無(wú)病理性核分裂;結(jié)直腸癌組（HE×400），腺體不規(guī)則，呈背靠背融合，可見(jiàn)成角及壞死，間質(zhì)纖維化、浸潤(rùn)。細(xì)胞重度異型，核分裂多見(jiàn)，并可見(jiàn)病理性核分裂。

2.2 結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸腺瘤組、正常結(jié)直腸組中Claudin-3的表達(dá)

結(jié)直腸癌組中的Claudin-3表達(dá)水平明顯高于結(jié)直腸腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.123，P<0.05）;結(jié)直腸癌組中Claudin-3表達(dá)水平也顯著高于正常結(jié)直腸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.459，P<0.05），見(jiàn)圖2、表1。Spearman相關(guān)性分析顯示Claudin-3的表達(dá)水平在正常結(jié)直腸組、結(jié)直腸腺瘤組、CRC組中呈中度正相關(guān)（r=0.490，P=0.000）。

2.3 Claudin-3在不同臨床病理參數(shù)CRC患者中的表達(dá)

2.3.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 與結(jié)直腸癌組伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的Claudin-3表達(dá)水平相比，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組中的Claudin-3表達(dá)水平明顯低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.010，P<0.05），見(jiàn)表2。Spearman相關(guān)性分析顯示Claudin-3的表達(dá)水平與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈中度正相關(guān)（r=0.675，P=0.000）。

2.3.2 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 本研究中，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例只有1例，表達(dá)水平為2.164 38，較無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（0.875 62±0.668 54）明顯高，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)太少，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3.3 TNM分期 Ⅲ期結(jié)直腸癌組中的Claudin-3表達(dá)水平顯著高于Ⅰ期結(jié)直腸癌組和Ⅱ期結(jié)直腸癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.185、2.943，P=0.001、0.007），見(jiàn)表3。Ⅳ期僅1例，不參與統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。Spearman相關(guān)性分析顯示Claudin-3的表達(dá)差異在CRC不同TNM分期中具有高度的正相關(guān)性（r=0.709，P=0.000）。

2.3.4 組織學(xué)分級(jí) Claudin-3在組織學(xué)分級(jí)中的高分化（1級(jí)）中的表達(dá)結(jié)果低于中分化（2級(jí)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.406，P=0.025）;中分化的表達(dá)水平也低于低分化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.362，P=0.026），見(jiàn)表4;Spearman相關(guān)性分析顯示Claudin-3的表達(dá)水平在高分化組、中分化、低分化組中依次升高，呈中度正相關(guān)（r=0.650，P=0.000）。

2.3.5 其他臨床病理參數(shù) Claudin-3在CRC組織中的表達(dá)水平與患者年齡、性別及腫瘤大小、部位無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表5。

3 討論

TJ是細(xì)胞黏附的主要方式之一，調(diào)控著細(xì)胞旁通路的通透性，保持細(xì)胞極性。Claudin是構(gòu)成TJ的主要蛋白之一，Claudin的表達(dá)水平的改變會(huì)使得細(xì)胞極性破壞、細(xì)胞黏附能力下降，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，但其確切的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。

本文研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組中的緊密連接蛋白-3的表達(dá)水平明顯高于結(jié)直腸腺瘤組及正常結(jié)直腸組，另外，結(jié)直腸腺瘤組的緊密連接-3蛋白量也顯著高于正常結(jié)直腸組。Spearman分析提示Claudin-3的表達(dá)水平呈中度正相關(guān)。Tokuhara等[3]通過(guò)體外細(xì)胞研究同樣發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白-3在CRC細(xì)胞中呈高表達(dá)，提示Claudin-3表達(dá)的上調(diào)可能參與惡性腫瘤的發(fā)生。目前對(duì)于其具體作用機(jī)制尚未完全明確。但有研究報(bào)道，當(dāng)Claudin蛋白的表達(dá)異常時(shí)，使得上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)胞旁通路通透性的調(diào)節(jié)異常及獲取侵襲表型從而向具有可以活動(dòng)特性的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌癥的發(fā)生[4]。

目前對(duì)于Claudin-3在CRC組織中的表達(dá)水平上升的機(jī)制仍未完全清楚。Wang等[5]通過(guò)小鼠動(dòng)物模型對(duì)CRC組織中的Claudin-3蛋白表達(dá)情況的改變進(jìn)行體內(nèi)、外研究，研究表明，Claudin-3在CRC組織中的水平可通過(guò)SCF/c-kit/JNK/AP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以使之升高，Claudin-3的異常表達(dá)可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。表明Claudin-3有可能成為CRC早期診斷的檢測(cè)指標(biāo)。

對(duì)于不同分化程度，Claudin-3的表達(dá)水平隨著CRC分化程度的不同差異明顯，分化程度越低，腫瘤惡性度越高，Claudin-3的水平越高。Claudin-3除了“屏障和柵欄”功能外，在細(xì)增增殖、分化中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)[6-7]。Escudero-Esparza等[8]研究認(rèn)為，緊密連接蛋白的表達(dá)異常使得腫瘤細(xì)胞早期出現(xiàn)黏附能力的丟失，細(xì)胞旁通路調(diào)節(jié)受損及細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到阻礙，而在腫瘤生長(zhǎng)晚期的時(shí)候，這種內(nèi)環(huán)境的改變令細(xì)胞極性丟失和細(xì)胞在生長(zhǎng)、分化上出現(xiàn)差異。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的緊密連接蛋白-3的水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，相關(guān)性分析顯示呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要步驟是對(duì)間皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲[9]，而腫瘤轉(zhuǎn)移涉及到一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，只有完成這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)，癌細(xì)胞才能轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處。而要完成上述轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)，必須得破壞TJ的屏障作用，導(dǎo)致細(xì)胞極性和細(xì)胞的黏附能力丟失。Claudin在癌癥細(xì)胞黏附功能的丟失、轉(zhuǎn)移過(guò)程起著非常重要的作用。因此，破壞Claudin蛋白維持TJ的完整性是轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵步驟。其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Claudin-3在其他癌組織中同樣具有類似的結(jié)果[10-11]。Tokuhara等[3]通過(guò)對(duì)體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，從CRC患者的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中分離出來(lái)的SW620細(xì)胞中Claudin-3的表達(dá)水平顯著升高，并且SW620細(xì)胞具有顯著的轉(zhuǎn)移特征，提示著Claudin-3的異常表達(dá)可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。而CRC患者的年齡、性別及腫瘤大小、部位與CRC組織Claudin-3的表達(dá)水平無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

而在治療方面，靶向藥物治療是目前惡性腫瘤治療的熱點(diǎn)研究方向。產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素是Claudin-3第二胞外環(huán)的高親和力天然配體，可以與Claudin-3結(jié)合形成膜孔復(fù)合物，使得細(xì)胞迅速死亡，并且Claudin-3在人類CRC、食管癌、上皮性卵巢癌等癌癥組織中均呈高表達(dá)，這為Claudin成為靶向治療惡性腫瘤提供了可能性。并且Pahle等[12]已經(jīng)報(bào)道了產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素基因在體內(nèi)外進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移靶向治療結(jié)腸癌成功的應(yīng)用。綜上所述，提示Claudin-3有可能成為CRC早期診斷的檢測(cè)指標(biāo)，并可能成為臨床治療CRC提供治療靶點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)Claudin-3在CRC組織的異常表達(dá)的研究較少，本研究不僅分析了Claudin-3在結(jié)直腸腺瘤與CRC之間的表達(dá)差異;同時(shí)分析了Claudin-3的異常表達(dá)與CRC不同病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討Claudin-3有可能成為CRC早期診斷的檢測(cè)指標(biāo)。但本研究樣本量較小，缺少對(duì)Claudin-3相關(guān)機(jī)制及調(diào)節(jié)劑的研究及研究時(shí)間短;以期能多中心合作，擴(kuò)大樣本量，為Claudin-3能否成為CRC早期診斷的檢測(cè)指標(biāo)及臨床治療CRC提供治療靶點(diǎn)提供更多依據(jù)。

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（收稿日期：2019-01-14） （本文編輯：何玉勤）