肺腺癌患者胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá)與性別、年齡及吸煙的關(guān)系

孫小迪，張麗媛，韓宜秀，李若葆，林濤，王柏林，黃琰

(濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053)

目前，惡性腫瘤居于我國(guó)居民死亡原因的第2位，僅次于心腦血管疾病，其中肺癌的發(fā)病率和病死率居所有腫瘤首位。肺癌最常見的組織病理學(xué)類型為腺癌，胸腔積液是晚期肺腺癌最常見的并發(fā)癥之一。分子靶向治療是晚期肺腺癌患者最重要的治療手段，基因檢測(cè)對(duì)于選擇合理的分子靶向治療方案非常重要。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4(EML4)間變性淋巴瘤激酶(ALK)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為肺癌最重要的驅(qū)動(dòng)因子均已取得重大研究進(jìn)展，但存在中小醫(yī)院不能獨(dú)立開展基因檢測(cè)、檢查費(fèi)用昂貴等一系列問題[1]。對(duì)于肺腺癌合并胸腔積液患者，通過胸水細(xì)胞蠟塊檢測(cè)蛋白表達(dá)，可為靶向治療選擇提供更為簡(jiǎn)便的方法?；诖耍狙芯客ㄟ^免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺腺癌患者胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá)情況，探討3種因子蛋白表達(dá)與患者臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，從而為肺癌的有效治療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 篩選濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2015年5月～2018年4月經(jīng)病理確診的肺癌患者92例，男43例、女49例，年齡42～85(61.68±8.30)歲?；颊卟±碓\斷根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織(WHO)頒布的肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，病理分期按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)最新公布的第8版肺癌TNM分期。入組標(biāo)準(zhǔn)：①組織類型為肺腺癌；②UICC第8版肺癌TNM分期為Ⅳ期；③合并胸腔積液；④胸水細(xì)胞蠟塊經(jīng)HE染色查找到腫瘤細(xì)胞；⑤有完整可靠的病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有其他惡性腫瘤病史；②曾接受胸腔灌注化學(xué)藥物治療；③胸水細(xì)胞蠟塊經(jīng)HE染色未查找到腫瘤細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞蠟塊的制作 將送檢胸水樣本加入保存液，靜置1 h；棄去上清液，留取底部沉淀少于50 mL，搖勻。倒入50 mL離心管，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液(血性標(biāo)本需加入醋酸乙醇10 mL，振蕩均勻，2 000 r/min離心5 min，去除血細(xì)胞干擾)。將沉淀加入甲醛溶液5 mL，振蕩，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加95%乙醇10 mL，振蕩，2 000 r/min離心5 min(對(duì)于沉淀較少的標(biāo)本，換用1.5 mL離心管，12 000 r/min高速離心)。常規(guī)取以上處理胸水樣本，擦鏡紙包裹，放入取材盒，快速脫水處理3 h，包埋，切片。

1.3 胸水細(xì)胞HE染色 將石蠟切片置于烘箱中76 ℃烤4 h，取出切片立即放入二甲苯Ⅰ中15 min、二甲苯Ⅱ中15 min至透明。將切片取出稍甩去二甲苯，依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min；蒸餾水沖洗3～5次，稍甩干水分后蘇木素染色5～10 min，自來水沖洗3次；放入1%鹽酸乙醇中5～10 s，自來水沖洗3次；放入1%氨水10～20 s，蒸餾水沖洗3次。1%伊紅液染色2～3 min。依次放入70%乙醇1 min、80%乙醇1 min、95%乙醇Ⅰ2 min、95%乙醇Ⅱ2 min、無(wú)水乙醇Ⅰ3～5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ3～5min；中性樹膠封片。顯微鏡下篩檢，92例均查見腫瘤細(xì)胞。

1.4 胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法，所有抗體及工作液均購(gòu)自福州邁新公司。將HE染色查見腫瘤細(xì)胞的蠟塊制作4 μm厚切片，76 ℃烤片4 h。一抗選用EGFR、ALK、VEGF，按照一抗要求進(jìn)行Eli Vision兩步法染色，DAB顯色，再以蘇木素復(fù)染，用中性樹膠封固，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。EFGR蛋白表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜棕黃色顯色為(+)，無(wú)棕黃色顯色為(-)。ALK蛋白表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞中存在很強(qiáng)的顆粒狀胞質(zhì)染色為(+)，但應(yīng)排除一些已知染色因素，如肺泡巨噬細(xì)胞中淺色胞質(zhì)點(diǎn)狀著色、神經(jīng)來源細(xì)胞染色、腺上皮染色、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)中一些散在的淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞染色；細(xì)胞內(nèi)不存在強(qiáng)顆粒狀胞質(zhì)染色為(-)。VEGF蛋白表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃著色為(+)，細(xì)胞胞質(zhì)未著色為(-)。染色結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師共同閱片，以組織學(xué)樣本診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞蠟塊IHC制片背景清晰，核結(jié)構(gòu)完整，著色部位正確。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá)與性別、年齡及是否吸煙的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胸水腫瘤細(xì)胞HE染色鏡下表現(xiàn) 腫瘤細(xì)胞核大、深染，核質(zhì)比例高，細(xì)胞大小及形態(tài)(多形性)與正常細(xì)胞比較差異明顯，核分裂象增多。

圖1 HE染色鏡下腫瘤細(xì)胞圖像(400×)

2.2 胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá) 92例晚期肺腺癌患者EGFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性44例，陽(yáng)性率為47.83%；ALK蛋白表達(dá)陽(yáng)性14例，陽(yáng)性率為15.22%；VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性37例，陽(yáng)性率為40.22%；其中同時(shí)存在EGFR和ALK蛋白表達(dá)陽(yáng)性1例，同時(shí)存在EGFR和VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性4例，同時(shí)存在VEGF和ALK蛋白表達(dá)陽(yáng)性2例，三種蛋白表達(dá)均為陰性患者4例。

2.3 胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá)與患者性別、年齡及吸煙的關(guān)系 女性、不吸煙肺腺癌患者EGFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別高于男性、吸煙者(P均<0.05)，不同年齡之間EGFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；年齡<60歲患者ALK蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于≥60歲患者(P<0.05)，不同性別、是否吸煙間ALK蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)；不同性別、年齡及是否吸煙患者VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌患者性別、年齡及吸煙的關(guān)系見表1。

表1 3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)與肺腺癌患者性別、年齡及吸煙的關(guān)系

3 討論

晚期肺腺癌合并胸腔積液患者體質(zhì)較差，傳統(tǒng)檢查及治療手段多難以耐受，精準(zhǔn)靶向治療已成為晚期肺腺癌的患者的首選治療手段。EGFR、ALK、VEGF為肺腺癌發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)基因，是當(dāng)前晚期肺腺癌患者靶向治療的研究熱點(diǎn)，通過細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化技術(shù)檢測(cè)肺癌患者胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá)簡(jiǎn)便易行[2]。

EGFR是一種上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)受體，屬于ErbB受體家族的一員。EGFR在許多實(shí)體腫瘤中存在高表達(dá)或異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，是決定患者是否能夠應(yīng)用EGFR抑制劑治療的先決條件[3]。本研究結(jié)果顯示，晚期肺腺癌合并胸腔積液患者EGFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為47.83%，與Zhang等[4]結(jié)論基本一致。有研究表明[5,6]，EGFR陽(yáng)性表達(dá)與患者種族、性別、是否吸煙、病理類型密切相關(guān)，且在亞洲女性、非吸煙腺癌患者中陽(yáng)性表達(dá)率較高。本研究結(jié)果顯示，在晚期肺腺癌合并胸腔積液患者中，女性、不吸煙患者EGFR表達(dá)陽(yáng)性率高于男性、吸煙患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EML4-ALK融合基因于2007年首次被Soda等[7]發(fā)現(xiàn)，其由EML4基因與ALK基因重排形成。細(xì)胞蠟塊是晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) ALK檢測(cè)的良好替代物，多個(gè)回顧性研究均證實(shí)NSCLC細(xì)胞蠟塊中ALK重排發(fā)生率約為5%。研究顯示，中國(guó)NSCLC患者ALK表達(dá)陽(yáng)性率為3%～11%[8]。楊文麗等[9]研究顯示，EML4-ALK融合基因表達(dá)更容易發(fā)生在女性、年齡≤60歲、不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者。這可能與雌激素水平有關(guān)。本研究?jī)H對(duì)晚期肺腺癌合并胸腔積液患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ALK表達(dá)陽(yáng)性率為15.22%，且多發(fā)生于<60歲年輕患者，與性別、是否吸煙無(wú)關(guān)。有研究還發(fā)現(xiàn)，EGFR表達(dá)陰性患者中，ALK表達(dá)陽(yáng)性率較高[10]。VEGF廣泛分布于人體的各個(gè)器官組織中，是一種能夠產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子。其與血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性酪氨酸激酶受體結(jié)合，可促進(jìn)血管生成，也是迄今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的血管生成因子。本研究發(fā)現(xiàn)，在晚期肺腺癌合并胸腔積液的患者中，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率約為40.22%，且與性別、年齡、是否吸煙無(wú)關(guān)。此與葉麗新[11]報(bào)告類似。大多數(shù)研究認(rèn)為，同一個(gè)患者一般不會(huì)同時(shí)發(fā)生兩種或多種蛋白表達(dá)[12,13]，但是本研究有少數(shù)患者同時(shí)存在2種蛋白陽(yáng)性表達(dá)，提示EGFR、ALK及VEGF蛋白表達(dá)可能存在相互聯(lián)系。但是，本研究例數(shù)較少，EGFR、ALK及VEGF表達(dá)之間是否真正具有相關(guān)性還有待加大樣本進(jìn)行深入研究。

胸腔積液是晚期肺腺癌患者最常見的并發(fā)癥之一，常導(dǎo)致胸悶、氣促、肺不張、肺部感染等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，故積極尋求合理的治療方案對(duì)晚期肺腺癌患者至關(guān)重要。胸水細(xì)胞學(xué)檢查可為合并胸腔積液肺腺癌患者查找致病基因提供便捷檢測(cè)手段[14]，分子靶向治療晚期肺腺癌患者也已取得極大進(jìn)展。對(duì)于胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者可行基因測(cè)序等檢查，進(jìn)一步行個(gè)體化分子靶向治療。