NOD2致高同型半胱氨酸血癥小鼠心室重構(gòu)的作用及其機制

李香，秦詠，王維，蘇紅燕，曹曉青

(山東省胸科醫(yī)院，濟南250013)

臨床研究顯示，高同型半胱氨酸血癥(hHcys)是心血管疾病及血管栓塞性疾病獨立重要的危險因素[1,2]，血清同型半胱氨酸(Hcy)水平升高與慢性心力衰竭的發(fā)生以及嚴重程度有關(guān)[3,4]。hHcys能誘導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化和血管周圍纖維化，導(dǎo)致心肌硬度增加、心肌重構(gòu)，進而誘發(fā)慢性心力衰竭。最近研究表明，內(nèi)源性免疫系統(tǒng)在心血管疾病的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用[5]。先天免疫系統(tǒng)是機體防御病原體入侵的第一道防線，它通過特殊的模式識別受體感知病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式來識別入侵的病原體。N樣受體是模式識別受體家族中主要的受體，目前已發(fā)現(xiàn)22個N樣受體成員，其中最有代表性的是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)。研究發(fā)現(xiàn)，NOD2與糖尿病、腎缺血再灌注損傷、心肌梗死等多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)[6～8]，NOD2可通過調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡及炎癥反應(yīng)參與心肌缺血再灌注損傷。目前為止，hHcys所致心室重構(gòu)的發(fā)生機制仍不清楚。為此，本文就NOD2在hHcys心肌組織中表達及其意義進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J野生雄性(WT)小鼠20只，體質(zhì)量22～28 g，購自山東大學(xué)實驗動物中心；胱硫醚β合酶(CBS)+/-鼠(CBS敲基因鼠，strain name:B6.129P2-Cbstm1Unc/J, stock number: 002853)、NOD2-/-鼠 (NOD2敲基因鼠，strain name: B6.129S1-NOD2tmlFlv/J, stock number: 005763)各20只，均購自美國Jackson實驗室；7500多普勒超聲心動圖儀(美國飛利浦)，實時定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，倒置相差顯微鏡及攝像系統(tǒng)(Olympus, 日本)。NOD2抗體(Protein Tech Group，美國)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體(Abcam，美國)，氯仿、異丙醇、100%乙醇(上?；瘜W(xué)試劑有限公司，中國)，Trizol試劑(Invitrogen 生物有限公司，美國)。

1.2 動物飼養(yǎng)及建模 WT鼠、CBS+/-鼠、NOD2-/-鼠分別再分為正常飲食、無葉酸飲食各10只，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±2)℃，濕度(50±5)%，鼠房通風(fēng)條件良好，喂養(yǎng)10周，建立hHcys小鼠模型。

1.3 超聲心動圖檢測 喂養(yǎng)10周以后，小鼠經(jīng)1.5%異氟烷吸入麻醉，用Philips 7500小動物超聲系統(tǒng)進行經(jīng)胸超聲心動圖檢查，探頭采樣頻率為12 MHz。由M型、二維、脈沖波多普勒和聲學(xué)密度圖像獲得小鼠心臟舒張末期左心室內(nèi)徑(LVIDd)、收縮末期左心室內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期后壁厚度(LVPWd)、左室縮短分數(shù)(FS)、射血分數(shù)(EF)。

1.4 血清Hcy濃度檢測 超聲心動圖檢查后取小鼠心臟血0.5 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清于-80 ℃保存，HPLC法檢測血清Hcy濃度。然后將小鼠灌流至死，取心肌組織放于高壓滅菌消毒的EP管或4%多聚甲醛中備用。

1.5 心肌組織NOD2 mRNA表達檢測 取適量心肌組織按Trizol試劑說明書經(jīng)兩相分離、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀等步驟提取總RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 gRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；取cDNA進行擴增，擴增體系為Tagmix 10 L、DDW 8 L、cDNA 1 L、引物1 L，其中NOD2 的上游引物是5’-CCTGGTACGTGCCCAAAGTAG-3’，下游引物是5’-GCCAAGTAGAAAGCGCAAA-3’；取8 L擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，照相于凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描，計算NOD2mRNA與GADPH mRNA比值。

1.6 心肌組織NOD2、MMP-9蛋白表達檢測 取心肌組織20 g，剪碎后加入適量的蛋白裂解液(含1%PMSF)，冰上研磨，靜置30 min，每10 min渦旋混勻1次。4 ℃ 12 000 r/min離心l0 min。吸取上清采用 BCA 法測定蛋白濃度。配置好相應(yīng)的電泳膠，蛋白定量之后進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟。封閉后加抗體4 ℃過夜，其中NOD2一抗?jié)舛葹?∶1 000、MMP-9一抗?jié)舛?∶600。TBS-T 洗 3 次并加入二抗孵育 1 h 后，再次用TBS-T 洗 3 次。顯影，掃描，應(yīng)用IDImage Analysis Software分析表達強度。以目的蛋白與β-actin的光密度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.7 心肌組織免疫組化染色 將固定在4%多聚甲醛的心肌組織包埋、切片、脫蠟、水化后，PBS洗滌3 min×3次，高壓修復(fù)，自然冷卻至室溫，PBS洗滌3 min×3次。用3%H2O2室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min×3次。滴加一抗NOD2(1∶200) 4 ℃過夜，PBS洗滌3 min×3次后滴加二抗室溫孵育1 h。PBS洗滌，鏡下二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸-乙醇分化，氨水返藍。梯度脫水，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 hHcys小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能變化 無葉酸飲食WT小鼠和CBS+/-小鼠血清Hcy濃度較正常飲食小鼠升高(P<0.05)，分別為正常飲食小鼠的2.1倍和4.5倍(圖1A)。與正常飲食小鼠比較，hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠FS減小(圖1B)，LVIDd、LVIDs增大(圖1 C-D)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。hHcys CBS+/-小鼠與同型WT小鼠比較，血清Hcy濃度升高、FS減小，LVIDd及LVIDs增大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

注：control為正常飲食，F(xiàn)F為無葉酸飲食；A 小鼠血清Hcy；B小鼠心臟FS；C小鼠心臟LVIDs；D小鼠心臟LVIDd；與control比較，*P<0.05；與EF WT小鼠比較，#P<0.05。

圖1 有無葉酸飲食WT 、CBS+/-小鼠血清Hcy濃度及心臟結(jié)構(gòu)功能變化

2.2 hHcys小鼠心肌組織NOD2表達 hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平較正常飲食小鼠均上調(diào)，hHcys CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平較同型WT小鼠上調(diào)(圖2A、2B)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。免疫組化染色NOD2在hHcys CBS+/-小鼠表達最強(圖2C)。

注：control為正常飲食，F(xiàn)F為無葉酸飲食；A小鼠心肌組織NOD2 mRNA；B 小鼠心肌組織NOD2 蛋白；C小鼠心肌組織NOD2蛋白免疫組化染色；與control比較，*P<0.05 ；與EF WT小鼠比較，#P<0.05。

圖2 有無葉酸飲食WT 、CBS+/-小鼠心肌NOD2表達

2.3 NOD2基因缺失對hHcys小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響 與正常飲食小鼠比較，無葉酸飲食WT、NOD2-/-小鼠血清Hcy水平升高，LVIDd增大，LVPWd、FS、EF減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。說明hHcys小鼠左室擴大，左室壁變薄，心功能降低。與WT hHcys小鼠比較，NOD2敲基因hHcys鼠左室擴大和室壁變薄現(xiàn)象減輕，心功能也有不同程度改善(P均<0.05)。見表1。

2.4 NOD2基因缺失后MMP-9蛋白表達變化 MMP-9在無葉酸飲食WT小鼠心肌組織中表達顯著升高，而NOD2敲除后MMP-9表達降低(圖3)。

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，它是蛋氨酸和半胱氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，也是能量代謝和許多需甲基化反應(yīng)的中間產(chǎn)物。正常人空腹血中Hcy水平為5～15 mol/L，含量大于15 mol/L時稱為hHcys。然而流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當Hcy的血濃度大于6.3 mol/L時，就會迅速增加心臟疾病的發(fā)生危險[1]。hHcys與動脈粥樣硬化和血栓發(fā)生密切相關(guān)，是心血管疾病、神經(jīng)退行性病變及妊娠相關(guān)疾病的危險因素[9～11]。動物實驗研究表明[3,12,]，高濃度的Hcy可致心臟血管周圍和間質(zhì)膠原增生，冠狀動脈壁增厚，心肌肥大細胞，炎性細胞浸潤，左室舒張壓升高，導(dǎo)致心室重構(gòu)和舒張功能下降。

表1 有無葉酸飲食WT 、NOD2-/-小鼠血清Hcy濃度及心臟結(jié)構(gòu)功能比較

注：與正常飲食比較，*P<0.05 ；與無葉酸飲食WT小鼠比較，#P<0.05。

注：control為正常飲食，F(xiàn)F為無葉酸飲食；與control比較，*P<0.05 ；與EF WT小鼠比較，#P<0.05。

圖3有無葉酸飲食及NOD2基因缺失小鼠MMP-9蛋白表達

造成hHcys的主要原因有：①富含甲硫氨酸飲食；②維生素(B12、B6、葉酸)缺乏；③Hcy代謝酶類基因改變，如CBS、5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)等基因突變或缺失；④腎功能降低。另外，還有其他的遺傳、生理、病理和營養(yǎng)因素都可引起Hcy升高，如高血壓、糖尿病和素食等。CBS是Hcy轉(zhuǎn)硫基化途徑中重要的催化酶，其基因突變能干擾CBS亞單位與血紅素和5-磷酸-吡哆醇的相互作用，從而使酶的活性降低或缺乏，進一步導(dǎo)致血漿Hcy水平升高[13]。CBS敲基因鼠是通過靶向刪除CBS基因而產(chǎn)生的，本課題采用的CBS+/-小鼠在正常飲食條件下未產(chǎn)生hHcys，而用無葉酸飲食可以檢測到較高的血漿Hcy水平，因此本課題hHcys動物模型采用無葉酸飲食方案。

研究表明[14]，Hcy能通過NMDA受體降低SERCA和肌集鈣蛋白的表達，增加PLB表達，這可能誘導(dǎo)了心臟收縮舒張功能障礙。本研究采用WT小鼠、CBS+/-小鼠無葉酸飲食建立hHcys模型，顯示hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠均出現(xiàn)心室重構(gòu)及心臟功能異常。而且，hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平較正常飲食小鼠均上調(diào)，hHcys CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平較hHcys WT小鼠上調(diào)，免疫組化染色NOD2在hHcys CBS+/-小鼠表達明顯增強。

研究發(fā)現(xiàn)，NOD樣受體可通過識別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，NOD2/CARD15基因多態(tài)性對冠狀動脈疾病的發(fā)生有重要影響[15]。Arg702Trp，Gly908Arg，Leu1007fsinsC是 NOD2/CARD15基因的3個單核苷酸多態(tài)性。Leu1007fsinsC多態(tài)性與臨床上冠狀動脈粥樣硬化和冠狀動脈斑塊不穩(wěn)定的風(fēng)險增加有關(guān)，而GLY908ARG多態(tài)性則表現(xiàn)出對冠狀動脈粥樣硬化的保護作用。有研究者[16]在冠心病患者的斑塊組織病變管腔側(cè)的炎性細胞中檢測到NOD2的表達。最近，liu等[17]研究表明，NOD2通過調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡和炎癥參與心肌缺血再灌注損傷。hHcys是心血管疾病的危險因素，NOD2在hHcys心肌組織中的表達及作用尚未見報道。為了進一步探討NOD2是否在hHcys引起的心功能障礙和心室重構(gòu)中發(fā)揮作用，我們選取NOD2敲基因鼠并建立hHcys模型，顯示NOD2基因缺失能減弱hHcys引起的心室重構(gòu)，小鼠心功能指標(EF、FS)在NOD2基因缺失后也得到不同程度的改善。

細胞外基質(zhì)(ECM)的降解在左室重構(gòu)中有重要作用。ECM是一個復(fù)合體，包含許多結(jié)構(gòu)蛋白、信號分子和蛋白激酶。所有的ECM包含物都容易被MMPs蛋白酶水解，改變間質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和生物活性的相互作用，因此MMPs決定著ECM的整個結(jié)構(gòu)和功能。MMPs不僅能降解基質(zhì)，也能調(diào)節(jié)膠原的合成，最終結(jié)果是MMPs表達升高的同時伴隨纖維化的增多。大量研究發(fā)現(xiàn)，在心室重構(gòu)期間，心肌MMP-9活性和表達都升高。MMP-9被認為是心室重構(gòu)的一個潛在的生物標志物，它能降解膠原，引起ECM 退化，導(dǎo)致心肌排列紊亂，收縮功能異常。hHcys動物模型中MMP-9表達顯著增加，并與炎癥、細胞外基質(zhì)降解和心臟功能失調(diào)有關(guān)[18]。大鼠喂以高蛋氨酸飼料8周后，血漿Hcy水平明顯升高，同時血漿MMP-9及動脈MMP-9mRNA的表達明顯增多，動脈損傷明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，hHcys大鼠心肌組織MMP-9表達顯著升高，NOD2缺失后MMP-9表達下調(diào)，說明NOD2-MMP-9信號通路對hHcys小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能有重要影響。

綜述所述，NOD2在hHcys心肌組織中高表達，NOD2可能通過調(diào)控MMP-9的表達參與hHcys小鼠的心室重構(gòu)過程。