SIRT1與肝細胞癌病理及預(yù)后的研究進展及靶向治療展望

林治華，王俊偉,鄧雅庭,李 靜,王 娟

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 重慶 400054; 2.靶向藥物篩選與活性評價重慶市高校重點實驗室， 重慶 400054; 3.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 重慶 400044)

肝細胞癌(HCC)為全球第五大常見惡性腫瘤，2016年，全球1 090萬例癌癥新增病例中，肝癌就有78.2萬例[1]。中國肝癌的患病、死亡率占亞洲近70%。在過去幾十年中，HCC的診斷和治療已經(jīng)取得了較大發(fā)展。然而，HCC仍然與高死亡率相關(guān)，即使治療被認為具有潛在治愈性，該腫瘤的預(yù)后還是很差[2]。此外，調(diào)控HCC發(fā)展和進展的分子變化和機制尚不清楚。肝病尤其是肝癌由于早期癥狀不明顯所以不易被人發(fā)現(xiàn)，在診斷出時癌細胞已大多發(fā)展到中晚期，錯過了良好的治療時機。因此，HCC在目前的治療手段主要是以手術(shù)結(jié)合放化療為主，預(yù)后效果很差，死亡率也極高。人們通常認為CD8+T細胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用，并且耗盡的CD8+T細胞有助于肝細胞癌(HCC)進展。NK細胞是肝臟中主要的淋巴細胞亞群和防御感染腫瘤的第1道防線，對其在HCC患者腫瘤進展中的特殊作用已有深入研究。NKG2A在NK細胞和NKG2A配體HLA-E在瘤內(nèi)肝癌組織中的表達增加。這些NK細胞，尤其是CD56dimNK細胞，NKG2A表達較高，表現(xiàn)為功能衰竭，預(yù)后較差[3]。因此，探求出新的HCC診斷標(biāo)識物和治療靶點是當(dāng)前研究的熱點。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2同系物1(SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙?；福谡５呐咛グl(fā)育、分化及維持自身平衡中是不可或缺的。SIRT1在從酵母到人類的進化過程中，是細胞代謝、長壽、衰老、凋亡、分化、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。SIRT1在細胞存活中的作用是通過關(guān)鍵細胞周期分子和凋亡調(diào)節(jié)蛋白[4](包括Foxo家族蛋白、Ku70、NF-Κb和p53)的脫乙?；瘉韺崿F(xiàn)的。

近年來，大量文獻表明，SIRT1在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[5-10]，因此SIRT1與腫瘤之間的關(guān)系也成為了腫瘤研究領(lǐng)域的一個熱點。

1 SIRT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

大量研究表明，在許多腫瘤組織中SIRT1的表達水平顯著增加，如白血病[5]、皮膚癌[6]、前列腺癌[7]、大腸癌[8]，并且其在控制細胞衰老和衰老中的功能可能與腫瘤發(fā)展和腫瘤細胞對SIRT1過表達的依賴性有關(guān)。SIRT1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有著兩種截然不同的作用：一方面，作為促進細胞存活的基因，SIRT1可能具有致癌功能。例如，SIRT1脫乙?；拖抡{(diào)p53，這可以延長細胞類型如神經(jīng)元和肌肉細胞的壽命，但是在具有分裂細胞的組織中會引起癌癥[9]。另一方面，作為促進生物存活的基因，SIRT1可能有腫瘤抑制功能[10]，這些在研究中一直存在爭議。如今，一些SIRT1抑制劑也被學(xué)者用于腫瘤相關(guān)研究，如表1所示。值得一提的是，僅僅只有3-TYP這種SIRT1抑制劑針對的腫瘤是肝細胞癌，并且該抑制劑還是SIRT3抑制劑，特異性不夠強。研究者發(fā)現(xiàn) SIRT1 在HCC組織及HCC系中的表達異常，增高數(shù)倍，SIRT1 的基因沉默可以顯著抑制HCC的生長并誘導(dǎo)其老化，這與SIRT1 在維持HCC的增殖及端粒末端的穩(wěn)定性上具有重要作用有關(guān)[3]，此外，SIRT1已被報道在HCC中起腫瘤啟動子的作用[11]，提示了SIRT1可能作為肝癌的一個新的標(biāo)識物以及治療靶點。

表1 SIRT1抑制劑

拮抗劑名稱結(jié)構(gòu)式針對腫瘤類型CAS號IC50值Sirtinol乳腺癌(MCF-7)、肺癌(H1299)410536-97-948 μm(In Vitro)EX 527肺癌(NCI-H460)、骨髓瘤(U-2 OS)、乳腺癌(MCF-7)49843-98-338 nM(In Vitro)Salermide白血病(MOLT4)、乳腺癌(MDA-MB-231)、結(jié)腸癌(SW480)1105698-15-4100 μm(In Vitro)Tenovin-6乳腺癌(MCF-7)1011557-82-621 μm(In Vitro)3-TYP肝癌(HepG2)120241-79-488 nM(In Vitro)

2 SIRT1在肝細胞癌中的臨床病理意義及預(yù)后

Jiang等[11]的研究表明，SIRT1是HCC的致癌蛋白，并且是肝癌手術(shù)切除后惡化結(jié)果的預(yù)測因子。他們的研究結(jié)果表明：SIRT1在HCC中過表達，發(fā)現(xiàn)SIRT1表達升高與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)。SIRT1的去乙?；富钚允歉渭毎┲蠸IRT1致癌作用的關(guān)鍵。當(dāng)SIRT1的去乙?；瘏^(qū)域發(fā)生突變時，HCC細胞增殖和集落形成受到抑制[12]。例如，SIRT1可以使LC3去乙酰化，在HepG2細胞中誘導(dǎo)自噬[13]。此外，p53是SIRT1研究最廣泛的靶點，SIRT1可以抑制細胞衰老和凋亡，從而刺激HCC中的腫瘤發(fā)生[14]。失活的SIRT1 (Ser 47上無磷酸化)可與突變的p53結(jié)合，從而激活A(yù)MPK/mTOR通路，在HCC中發(fā)揮致癌作用。Jiang等[11]的臨床病理分析顯示，SIRT1的表達增加與高表達的p53在HCC中相關(guān)(OR(odds ratio)=2.71,95%CI(confidence interval):1.39-5.29,P=0.003)。乙型肝炎病毒(HBV)是引起HCC的主要原因之一,SIRT1在hbv感染細胞中上調(diào)，其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制可以在HCC中上調(diào)[15]。在他們的臨床病理分析中可以發(fā)現(xiàn)：SIRT1表達增加在hbv感染的HCC中更為常見(OR=1.63,95%CI:1.04-2.57,P=0.03)。到目前為止，沒有有效的治療可用于HCC?；赟IRT1在癌細胞生長和存活中的功能作用，阻斷SIRT1活性可能有益于HCC患者，所以應(yīng)進一步研究以檢測這些抑制劑對HCC的影響。

3 SIRT1與c-Myc協(xié)同治療HCC的進展及預(yù)后

c-Myc基因是Myc基因家族的重要成員之一，具有可易位、調(diào)節(jié)多種物質(zhì)、無限增殖、促進細胞分裂等作用，c-Myc基因參于細胞凋亡并且與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

SIRT1在腫瘤發(fā)生中的作用在SIRT1和致癌c-Myc之間的關(guān)聯(lián)是有爭議的。最近，有報道稱c-Myc與SIRT1在腫瘤發(fā)生中呈正相關(guān)[16]。在結(jié)直腸癌中，c-Myc增加了SIRT1蛋白水平和SIRT1的脫乙酰酶活性[16]。此外，SIRT1還增加了c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性并在成纖維細胞中穩(wěn)定[16]。SIRT1介導(dǎo)的c-Myc脫乙?；黾恿薱-Myc的半衰期，并促進了c-Myc/Max關(guān)聯(lián)，從而抑制細胞衰老和抑制凋亡[16]。相反，早期的一份研究報告顯示，盡管c-Myc轉(zhuǎn)錄增加，SIRT1通過脫乙酰作用使c-Myc去穩(wěn)定化，因此表明SIRT1是Myc靶向性腫瘤發(fā)生的負調(diào)控因子[17]。在Yuan等[16]的研究中，證明SIRT1和c-Myc的表達呈正相關(guān)，并且均促進腫瘤細胞的增殖。在Tet-O-MYC細胞中誘導(dǎo)的c-Myc表達導(dǎo)致SIRT1相應(yīng)增加了表達，并且SIRT1的過表達也導(dǎo)致增加c-Myc表達。相反，致癌性c-Myc沉默導(dǎo)致SIRT1表達顯著且緊密。有趣的是，致癌c-Myc再激活導(dǎo)致SIRT1表達的迅速逆轉(zhuǎn)。人類HCC細胞系中SIRT1調(diào)節(jié)的生物學(xué)效應(yīng)與在小鼠Tet-O-MYC細胞中觀察到的相同。此外，人類HCC中的SIRT1表達與c-Myc和Ki67的表達顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)一起支持SIRT1和MYC在小鼠和人類肝細胞增殖和存活中的表達一致的作用。當(dāng)考慮c-Myc作為有效的致癌基因的作用時，這些結(jié)果表明SIRT1可以被認為是c-Myc在肝臟腫瘤發(fā)生中的重要靶標(biāo)。

根據(jù)c-Myc和SIRT1在Tet-O-MYC肝癌細胞中表達的正相關(guān)性[18]，Kim等[19]檢測到人類HCC中SIRT1和c-Myc之間存在顯著的免疫組化關(guān)系。此外，Sirt 1和c-Myc的表達預(yù)示HCC患者的OS(overall survival，總生存)和DFS(disease-free survival，無病生存期)更短。這些發(fā)現(xiàn)一起表明SIRT1似乎在肝臟腫瘤發(fā)生中具有重要作用。此外，c-Myc的表達與HCC患者已確定的不良臨床病理特征(包括低血清白蛋白和晚期臨床分期)顯著相關(guān)。此外，當(dāng)Yuan等[16]分析c-Myc和SIRT1對HCC患者的預(yù)后影響時，表達c-Myc和SIRT1的患者與不表達c-Myc和SIRT1的患者(平均總生存時間分別為48.456 7、115.086 7個月)相比顯示出更短的OS和DFS。因此，這些數(shù)據(jù)表明 c-Myc和SIRT1在肝腫瘤發(fā)生中以及c-Myc和SIRT1在肝臟腫瘤發(fā)生中的獨立作用之間存在相關(guān)性。類似于上述結(jié)果，先前已報道c-Myc表達與HCC的進展和不良預(yù)后相關(guān)[20]。然而，目前還不清楚SIRT1是否是HCC的真正預(yù)后指標(biāo)。最近的一篇報道提出SIRT1可能是HCC的預(yù)后指標(biāo)[16]，但其他報道無法發(fā)現(xiàn)SIRT1的預(yù)后意義。

值得注意的是，SIRT1表達也與HBV感染顯著相關(guān)。SIRT1通過其在HBV感染中誘導(dǎo)的組蛋白脫乙酰酶的活性也有助于肝臟腫瘤發(fā)生發(fā)展。為了進一步確定SIRT1準確的腫瘤促進機制，有必要進一步研究。

總之，這些研究結(jié)果表明：SIRT1與c-Myc在肝癌發(fā)生中協(xié)同作用，可能是調(diào)節(jié)肝癌的重要分子靶點。正如其他研究[21]發(fā)現(xiàn)抑制SIRT1可能是預(yù)防高?；颊吣[瘤發(fā)展的有效策略，或作為已建立腫瘤的治療策略?？傊?，研究結(jié)果表明SIRT1和c-Myc可能參與HCC的進展，并且這兩種分子都可以用作總體HCC預(yù)后的臨床指標(biāo)。

4 SIRT1在肝細胞癌中與P53之間的關(guān)系

人體抑癌基因p53的失活對腫瘤形成起重要作用，其野生型使癌細胞凋亡，從而防止癌變，而突變型則會促進癌變。p53腫瘤抑制基因是人類腫瘤中突變最頻繁的基因。

SIRT1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用存在爭議，以前的研究表明：SIRT1的功能取決于腫瘤發(fā)生的階段并且可能是腫瘤類型特異性的。在Zhang等[12]的研究中，他們通過體外、體內(nèi)和19項臨床研究證明了SIRT1、AMPK和p53在HCC中的重要作用。其數(shù)據(jù)表明SIRT1的作用取決于HCC細胞和腫瘤的p53突變狀態(tài)，這支持對HCC患者的預(yù)后和治療評估中的生物標(biāo)志物評估的需求。通常認為SIRT1會破壞細胞周期控制，并通過p53脫乙?；褪Щ畲龠M腫瘤發(fā)展，表明p53是SIRT1和SIRT1致癌活性之間的重要中間體[22]。 最近，有報道表明AMPK和SIRT1之間通過細胞NAD +動態(tài)水平相互作用[23]。

Ganesan等[24]推測SIRT1是誘導(dǎo)AMPK磷酸化和抑制mTOR通路所必需的，事實上，shRNA對SIRT1的抑制通過突變型p53細胞PLC5-sh SIRT1中的磷酸化AMPK降低激活了mTOR(Ser2448)的磷酸化[12]。

個別SIRT1靶標(biāo)的重要性可能取決于所研究的細胞過程和細胞類型[25]。然而已經(jīng)表明磷酸化SIRT1可以通過直接與必需因子(即mTOR)相互作用來調(diào)節(jié)細胞存活[26]。在這種情況下，Zhang等[12]的研究結(jié)果表明：磷酸化SIRT1(Ser47)仍然對突變p53 HCC中的應(yīng)激誘導(dǎo)的激活有響應(yīng)。此外，磷酸化SIRT1可通過某種腫瘤抑制途徑抑制HCC生長。

5 SIRT1在HCC細胞自噬中的作用

自噬是將自身的細胞質(zhì)蛋白或細胞器吞噬并包裹成囊泡的過程，從而實現(xiàn)細胞自身的代謝需要。在腫瘤研究中其作用尚未研究透徹。

保護性自噬已被證明是癌細胞化療耐藥的潛在機制[27]。Xiong等[28]研究表明：HULC(highly upregulated in liver cancer)引發(fā)的保護性自噬減弱了HCC細胞對化學(xué)治療劑的敏感性。另外，他們發(fā)現(xiàn)HULC通過上調(diào)SIRT1蛋白引起自噬。眾所周知，SIRT1通過調(diào)控Atg5、Atg7、Atg8、Beclin I、FoxO1、p53等許多重要的自噬組分誘導(dǎo)自噬[29]。他們的結(jié)果顯示HULC通過增強SIRT1介導(dǎo)的Atg5和Atg7的脫乙?；瘉泶龠MHCC細胞的自噬。此外，以前的報道將SIRT1在HCC中的高表達歸因于其翻譯后調(diào)節(jié)，因為SIRT1 mRNA在HCC和相鄰非癌組織之間沒有顯著差異[5]。Xiong等[28]首次證實HULC的上調(diào)至少部分是由于HCC中SIRT1蛋白的升高。隨后，USP22被鑒定為參與HULC介導(dǎo)的SIRT1誘導(dǎo)。同時，需要注意的是，在HULC過表達之后，MDM2(mdm2癌基因在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其發(fā)生突變與擴增轉(zhuǎn)移，而且mdm2突變與p53突變不共存)似乎略微減少。最近，據(jù)報道，MDM2增強了SIRT1的泛素化并促進其在DNA損傷誘導(dǎo)的細胞死亡過程中的降解[30]，這可能提供了HULC調(diào)控SIRT1除USP22以外的另一種手段。當(dāng)然，它需要進一步的研究來闡明MDM2是否參與HULC介導(dǎo)的SIRT1誘導(dǎo)。

USP22是去泛素化酶(DUBs)的成員，可以催化去除靶蛋白中的泛素。USP22參與NAD+依賴性蛋白脫乙酰酶SIRT1[31]，以及組蛋白H2A和H2B的去泛素化[32]。最近，有證據(jù)表明，USP22參與了包括HCC在內(nèi)的多種癌癥預(yù)后不良相關(guān)的癌發(fā)生[33]。在Xiong等[28]的研究中，證明了lncRNA HULC可以顯著上調(diào)USP22的蛋白質(zhì)水平，并且USP22在介導(dǎo)HULC誘導(dǎo)的去泛素化和穩(wěn)定SIRT1在HCC細胞中具有關(guān)鍵作用。然而，在之前的報道顯示，USP22在調(diào)節(jié)SIRT1蛋白中發(fā)揮不同的作用。這些研究之間的差異可能歸因于各種細胞的背景或?qū)毎牟煌碳ひ蛩?。此外，他們篩選出3種新型miRNA(miR-6825-5p、miR-6845-5p和miR-6886-3p)，并證明它們可以直接靶向USP22 3’-UTR。有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)miR-6886-3p抑制USP22表達，盡管該miRNA未預(yù)測靶向USP22 3’-UTR。據(jù)報道，在miRNA的5’末端稱為“種子區(qū)域”的6到8nt(核苷酸酶)長的片段，并引發(fā)靶向mRNA反應(yīng)(促進mRNA降解或抑制mRNA翻譯)[34]。然而，越來越多的證據(jù)表明，存在與miRNA種子序列不完全互補但仍能有效抑制基因表達的“非規(guī)范”位點，并且約占種子序列相互作用的60%[35]。因此，miR-6886-3p抑制USP22表達應(yīng)該在HCC細胞中以非規(guī)范的方式進行。

HULC降低了3種miRNA(miR-6825-5p、miR-6845-5p和miR-6886-3p)的表達和活性[28]，提高了USP22蛋白質(zhì)水平，增強了去泛素化SIRT1并穩(wěn)定它，最終引發(fā)HCC細胞的自噬。此外，HULC/SIRT1/自噬途徑在化療藥物存在下被激活，通路的干擾增強了HCC細胞的化療敏感性?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)說明了HULC的一個新功能，“HULC/USP22/SIRT1 /保護性自噬”途徑可能成為開發(fā)HCC化療敏感策略的新靶點。

6 展望

隨著研究的深入，雖然有少數(shù)研究證明SIRT1在HCC的演變發(fā)展中起著抑制的作用，但是更多的研究表示，SIRT1促進了HCC的演變，這些觀察結(jié)果促使研究人員假設(shè)健康肝臟組織中的SIRT1活性可以抑制腫瘤的發(fā)生，然而在轉(zhuǎn)化后，SIRT1表達或其過表達可能為腫瘤細胞提供保護或存活優(yōu)勢。抑制SIRT1會損害動物模型中的腫瘤細胞生長，并且可能使用小分子抑制劑在體外和體內(nèi)實現(xiàn)抗腫瘤作用，并共同表明SIRT1可能是一種新型治療癌癥的靶標(biāo)。本實驗室丁雪壘等[36]的研究中，采用sybyl2.0藥物虛擬篩選軟件，選取 33個噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-甲酰胺類SIRT1-3抑制劑，進行三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)研究，為篩選高活性 SIRT1-3抑制劑的研究奠定基礎(chǔ)。抑制SIRT1的表達可能會有效地抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。SIRT1是否作為致癌基因或腫瘤抑制因子尚不清楚，但這些發(fā)現(xiàn)提供了有力的論據(jù)：SIRT1可能是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。SIRT1 的生物學(xué)功能多樣，且極為關(guān)鍵和重要，與人類的多種腫瘤也密切相關(guān)。然而，SIRT1 在HCC中自噬的作用還需要更深入的研究，SIRT1表達與性別、HBV感染、TNM分期、AFP水平、p53表達和腫瘤大小有關(guān)，但研究都不夠深入，在本實驗室丁雪壘[37]的研究中，選取SIRT1蛋白與尼克酰胺、EX527,在基于SIRT1受體下，通過高通量虛擬篩選以及分子模擬篩選并且合成出化合物T，通過CCK-8增殖抑制試驗、Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測、Western blot法、裸鼠模型等方法，得出該化合物對肝細胞癌HepG2有特異性的抑制作用。本實驗室的劉蒙蒙[38]在此基礎(chǔ)上，將HepG2細胞中的SIRT1進行敲除，采用CCK-8 增殖抑制法檢測化合物T對HepG2及其敲除細胞的增殖抑制率，得出化合物T對SIRT1敲除細胞均有一定的增殖抑制作用，所以小分子化合物T有望作為抗腫瘤藥物，特別是抗HCC的靶向藥物。盡管如此，關(guān)于SIRT1靶點針對肝細胞癌的抑制劑研究也不夠深入，如果以此作為切入點，對肝細胞癌的臨床研究與治療將會有一個很大的進展?？傊琒IRT1表達可能作為HCC潛在的治療靶點和預(yù)后指標(biāo)，為以后的研究提供了方向和路線。