鎘暴露對(duì)背角無齒蚌鰓和消化腺的氧化應(yīng)激

井維鑫，林子根，郎 朗，劉 娜，王 茜，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

鎘（Cd）主要毒性形式是鎘離子（Cd2+），是淡水水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛和長(zhǎng)期存在的、具有致癌作用的重金屬污染物[1-2]。在我國(guó)多個(gè)湖泊（尤其是東部和中部湖泊）沉積物中，Cd 污染程度達(dá)到中度到重度，其潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)最高[3]。Cd2+與鈣離子（Ca2+）等必需金屬離子競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入細(xì)胞[4]，可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成[5]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)形成的ROS過多時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死[1]。

軟體動(dòng)物雙殼類由于種類、數(shù)量較多，廣泛分布于世界范圍內(nèi)江河湖海之中，直接與水體和沉積物接觸，且運(yùn)動(dòng)能力弱，還具有低代謝率、高濾水率和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[6]，是較理想的水體中Cd 等重金屬污染的監(jiān)測(cè)生物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)貝類受到重金屬暴露時(shí)，其抗氧化系統(tǒng)可以起到消除ROS 的作用，可防止或減輕氧化損傷的發(fā)生[7]，對(duì)環(huán)境污染起到早期預(yù)警作用[8]。

背角無齒蚌（Anodonta woodiana）在我國(guó)分布廣泛[9]，具有改善水質(zhì)的作用和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[10]，其生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)能力強(qiáng)，作為“淡水貝類觀察”的指示生物，用于監(jiān)測(cè)和評(píng)估淡水環(huán)境Cd 等重金屬污染[11-12]。目前，就Cd2+致背角無齒蚌急性毒性的研究雖已有報(bào)道，但大多數(shù)檢測(cè)生物標(biāo)志物的種類不超過4 種[9，13-15]，且單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)抗氧化酶的測(cè)定，不足以說明完全的抗氧化防御[16-17]。鰓和消化腺是雙殼類動(dòng)物Cd2+暴露的重要靶器官[18]，在以往研究中，同時(shí)分析這2 種組織相關(guān)生物標(biāo)志物也較為少見[19]，且不同試驗(yàn)條件對(duì)生物標(biāo)志物有不同的影響，很難準(zhǔn)確評(píng)估生物標(biāo)志物的敏感性和指示性[16]。

本研究用亞慢性Cd2+暴露背角無齒蚌，檢測(cè)鰓和消化腺中7 種生物標(biāo)志物的變化，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T-AOC）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA），旨在篩選出用于淡水環(huán)境Cd污染監(jiān)測(cè)與評(píng)估的生物標(biāo)志物，為背角無齒蚌作為“淡水貝類觀察”的指示生物積累相關(guān)的研究資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

背角無齒蚌購于山西太原五龍口水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。購回后置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用曝氣48 h 的自來水清洗，去除蚌體表面附著物及泥沙等雜質(zhì)，而后在實(shí)驗(yàn)室條件下（水溫（14.65±0.31）℃，溶解氧（9.75±0.26）mg/L，pH 值8.34±0.12）飼養(yǎng)28 d。前14 d 不喂食，后14 d 投喂小球藻（每只每天喂食3.5×104個(gè)）。

1.2 主要試劑

氯化鎘水合物（CdCl2·2.5H2O）（分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%過氧化氫（H2O2）（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司。SOD、CAT、GPx、GST、GSH、MDA 和T-AOC 測(cè)試盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)96 h Cd2+的LC50（134.9 mg/L）[15]設(shè)置Cd2+質(zhì)量濃度為2.698 mg/L，進(jìn)行Cd2+暴露，試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)平行。選取大小相近的背角無齒蚌（20 只）置于聚丙烯塑料飼養(yǎng)箱（72 cm×52 cm×44 cm）內(nèi)，染毒液體積為20 L。每2 d 換水一次，每天喂食一次。試驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體。

1.3.2 樣品制備 在Cd2+暴露0（CK），7，14，21，28 d，隨機(jī)選取4 只蚌，解剖取鰓和消化腺，用濾紙吸凈組織表面水分，迅速稱質(zhì)量后用液氮速凍，保存于低溫冰箱（-80 ℃）備用。以預(yù)冷的PBS 緩沖液在冰上制備20%的組織勻漿液，2 800 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，用于各生物標(biāo)志物的測(cè)定。

1.3.3 測(cè)定方法 SOD、CAT、GPx、GST、GSH、MDA和T-AOC 的測(cè)定均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。試驗(yàn)中吸光度的測(cè)定均通過多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，美國(guó)MD 公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并應(yīng)用Tukey HSD 方法比較顯著性差異（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以GraphPad Prism 6 進(jìn)行柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對(duì)背角無齒蚌脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的影響

背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露后，鰓MDA 含量隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，除在7 d 與對(duì)照組間無顯著差異外，其余各組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。消化腺M(fèi)DA 含量雖有升高的趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較均無顯著差異（圖1）。

2.2 鎘對(duì)背角無齒蚌抗氧化酶SOD、CAT、GPx和GST 活性的影響

背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露后，鰓SOD 活性與對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05），且隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，并在21 d 達(dá)到最低值，為對(duì)照組的71%。消化腺SOD 活性在Cd2+暴露14，28 d 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別是對(duì)照組的1.3 倍和1.2 倍（圖2）。

背角無齒蚌鰓和消化腺CAT 活性的變化如圖3 所示。經(jīng)Cd2+暴露后，鰓CAT 活性與對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05）。消化腺CAT 活性除7 d 外，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在21 d 達(dá)到最高值，是對(duì)照組的1.7 倍。

背角無齒蚌鰓GPx 活性在Cd2+暴露14 d 顯著 低于對(duì)照組（P＜0.05）；消化腺GPx 活性除在14 d與對(duì)照組間無顯著差異外，其余暴露時(shí)間均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。鰓和消化腺GPx 活性變化隨Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)均表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，都在14 d 達(dá)到最低值（圖4）。

Cd2+暴露后，背角無齒蚌鰓GST 活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，除在28 d 與對(duì)照組相比無顯著差異外，其余暴露時(shí)間均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。消化腺GST 活性表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，在7，28 d 均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖5）。

2.3 鎘對(duì)背角無齒蚌抗氧化劑GSH 含量的影響

Cd2+暴露后，背角無齒蚌鰓和消化腺GSH 含量高于對(duì)照組。鰓GSH 含量在14，21 d 顯著高于對(duì)照組，且在21 d 達(dá)到最高值，是對(duì)照組的1.8 倍。消化腺GSH 含量除在28 d 與對(duì)照組間無顯著差異外，其余暴露時(shí)間均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），并在14 d 達(dá)到最高值，是對(duì)照組的1.7 倍（圖6）。

2.4 鎘對(duì)背角無齒蚌T-AOC 水平的影響

背角無齒蚌鰓T-AOC 水平隨Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，并在28 d 達(dá)到最高值且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。消化腺T-AOC 水平則表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在21 d 達(dá)到最高值且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖7）。

3 討論

在正常條件下，機(jī)體內(nèi)ROS 的生成和清除是動(dòng)態(tài)平衡的[1，5]。當(dāng)重金屬等外界環(huán)境脅迫因素作用時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS，過量ROS 的積累破壞了這種平衡狀態(tài)[5]，導(dǎo)致蛋白氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷[17]。MDA 是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，可以反映生物體受ROS 攻擊的程度[20]，是脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激的重要生物標(biāo)志物[21]。許多研究發(fā)現(xiàn)，雙殼類動(dòng)物經(jīng)Cd2+暴露后，機(jī)體內(nèi)MDA 的含量升高[8，18，22]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)Cd2+暴露后，淡水雙殼類Pyganodon grandis 消化腺[23]和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）鰓[24]MDA 含量無顯著變化。本研究中，背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露后，鰓MDA 含量在14，28 d 顯著高于對(duì)照組，而消化腺M(fèi)DA 含量卻與對(duì)照組無顯著差異。表明鰓受到的氧化損傷更大，或消化腺應(yīng)對(duì)Cd2+暴露的抗氧化能力更強(qiáng)[8]。

生物體的抗氧化系統(tǒng)（包括抗氧化酶和非酶抗氧化劑）可以清除多余的ROS[7]，以保護(hù)生物體免受氧化損傷[5]。SOD 和CAT 是對(duì)抗氧化應(yīng)激的第一道防線[1]。SOD 廣泛存在于有機(jī)體中，可將超氧陰離子（O2-·）轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2）[7]，隨后被CAT 和（或）GPx 分解[5，8]。研究發(fā)現(xiàn)，SOD、CAT 和GPx 在抗氧化防御上具有一定的協(xié)同性[17，25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，鰓和消化腺的SOD、CAT 和GPx 活性呈現(xiàn)一致性的結(jié)果，這3 種抗氧化酶活性在鰓中均表現(xiàn)出不同程度的抑制，而在消化腺中則表現(xiàn)出不同程度的誘導(dǎo)。有文獻(xiàn)報(bào)道，背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露24～96 h，鰓SOD 和CAT 活性被誘導(dǎo)，GPx 活性無顯著變化[15]；葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）經(jīng)Cd2+暴露28 d，鰓SOD、CAT 和GPx 活性被抑制[26]。本研究中，背角無齒蚌鰓SOD、CAT 和GPx 活性均被抑制，表明經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的Cd2+暴露后，鰓可能聚集了大量的ROS，使得SOD 過度消耗[17]。也有可能是Cd2+改變了SOD 的空間構(gòu)象，造成SOD 活性的降低[14]。除此之外，Cd2+也會(huì)對(duì)SOD 基因表達(dá)造成影響，從而使其酶活性降低[14]。而SOD 活性的降低也使其歧化反應(yīng)產(chǎn)物H2O2減少，導(dǎo)致CAT 和GPx 沒有被激活。Cd2+可結(jié)合GPx 前體，使GPx 的合成受到抑制[27]，也可結(jié)合GPx 的活性部位（Se-Cys），使GPx 失活[28]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄牙牡蠣經(jīng)Cd2+暴露28 d，消化腺SOD活性無顯著變化、CAT 活性被抑制、GPx 活性被誘導(dǎo)[26]；背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露72 h，消化腺SOD 和CAT 活性被誘導(dǎo)[14]；文蛤（Meretrix meretrix）經(jīng)Cd2+暴露5 d，消化腺SOD 和CAT 活性被誘導(dǎo)，GPx 活性被抑制[22]。本研究中，背角無齒蚌消化腺SOD、CAT 和GPx 活性被誘導(dǎo)，表明Cd2+暴露后，當(dāng)大量的Cd2+被轉(zhuǎn)運(yùn)至消化腺并誘導(dǎo)其產(chǎn)生了大量O2-·，促使機(jī)體啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)SOD 活性升高，以保護(hù)機(jī)體免受損傷[14]。同時(shí)，機(jī)體內(nèi)H2O2也由于SOD活性的升高而增多[29]，促使機(jī)體內(nèi)CAT 和GPx 活性升高，從而清除過量的H2O2[30]。Cd2+暴露28 d，CAT活性稍有降低，但仍顯著高于對(duì)照組，同時(shí)GPx 活性繼續(xù)升高，這也充分說明二者共同清除H2O2，起到保護(hù)機(jī)體的作用[7]。

GST 是一種Ⅱ相解毒酶[17]，也是一種重要的抗氧化酶[19]，可催化Cd2+與GSH 的巰基（-SH）偶聯(lián)，形成復(fù)合物GS-Cd 進(jìn)行解毒[7]。GSH 是一種三肽，是維持水生生物氧化還原平衡的主要抗氧化劑[7]，可以直接清除ROS[8]，同時(shí)也是GST 和GPx 催化解毒反應(yīng)的共同底物[17]。有研究報(bào)道，背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露96 h，鰓GST 活性表現(xiàn)為抑制—誘導(dǎo)，GSH 含量顯著低于對(duì)照組[19]。本研究中，鰓GST 活性均表現(xiàn)為誘導(dǎo)，但GSH 含量顯著高于對(duì)照組。隨Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，鰓SOD、CAT 和GPx 活性均表現(xiàn)為抑制—恢復(fù)，而GST 和GSH 則表現(xiàn)為誘導(dǎo)—恢復(fù)。同時(shí)，鰓GST 與GPx 活性在Cd2+暴露14～28 d呈明顯的負(fù)相關(guān)。說明一方面在SOD、CAT 和GPx活性受到抑制時(shí)，GST 和GSH 代償性的發(fā)揮了抗氧化作用[25]；另一方面，GST 與GPx 也在爭(zhēng)奪共同的反應(yīng)底物GSH[17]。鰓GSH 含量和GST 活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)均是升高—降低，這可能說明鰓GSH 主要用作GST 反應(yīng)底物，而不是用來清除ROS。另外有研究發(fā)現(xiàn)，背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露96 h，消化腺GST 活性被誘導(dǎo)[19]，菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）經(jīng)Cd2+暴露48 h，消化腺GST活性被抑制[31]；背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露96 h[19]，文蛤經(jīng)Cd2+暴露5 d，消化腺GSH 含量顯著低于對(duì)照組[22]。本研究中，消化腺SOD、CAT、GPx 和GST活性均表現(xiàn)為誘導(dǎo)，GSH 含量也顯著高于對(duì)照組，GST 與GPx 活性呈正相關(guān)。這表示消化腺中這些抗氧化酶（劑）被共同調(diào)動(dòng)抵抗Cd2+暴露帶來的氧化損傷。隨Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，消化腺GST 活性變化趨勢(shì)為誘導(dǎo)—恢復(fù)—誘導(dǎo)，GSH 含量的變化趨勢(shì)是升高—降低。這可能表明，消化腺GSH 除了給GST 和GPx 作為反應(yīng)底物，同時(shí)也直接參與ROS清除。消化腺是雙殼類動(dòng)物的重要解毒器官，Cd2+可從體內(nèi)其他器官轉(zhuǎn)運(yùn)至消化腺[32]，產(chǎn)生較多的ROS導(dǎo)致GSH 大量消耗[8]。

T-AOC 是反映機(jī)體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化劑共同的抗氧化能力，也是監(jiān)測(cè)水體重金屬污染的重要生物標(biāo)志物[16]。背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露24～96 h，鰓T-AOC 表現(xiàn)為持續(xù)升高，消化腺先升后降[33]，這和本研究中T-AOC 的變化趨勢(shì)一致。鰓T-AOC 的不斷增強(qiáng)，表示其正積極對(duì)抗Cd2+暴露帶來的氧化損傷。Cd2+暴露28 d，鰓SOD 等抗氧化酶活性和GSH 含量與對(duì)照組相比無顯著升高，表明鰓可能也通過過氧化物酶（POD）、金屬硫蛋白（MT）等其他抗氧化酶（劑）抵抗Cd2+作用。SOD 等抗氧化酶在Cd2+暴露28 d 仍保持較高的活性，這可能說明消化腺其他抗氧化酶（劑）受到明顯的抑制。而消化腺T-AOC 在28 d 的降低，可能預(yù)示著隨著Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，消化腺氧化損傷的程度將加重。

背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露后，鰓和消化腺抗氧化指標(biāo)的不同表現(xiàn)主要是由組織特異性所導(dǎo)致的[1]。雙殼類軟體動(dòng)物具有多片鰓，與水直接接觸，可以反映短期內(nèi)鎘污染狀況[34]。而消化腺與哺乳動(dòng)物的肝臟類似，具有解毒的重要生理功能，是中長(zhǎng)期Cd2+暴露的靶器官[41]。同時(shí)，在應(yīng)對(duì)Cd2+暴露，消化腺比鰓的能力更強(qiáng)[8，17]。本研究中關(guān)于MDA 的試驗(yàn)結(jié)果也證明消化腺受到的氧化損傷更小。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，背角無齒蚌經(jīng)Cd2+暴露后，鰓和消化腺共同應(yīng)對(duì)Cd2+暴露帶來的氧化損傷。其中，鰓SOD、CAT 和GPx 活性受到抑制，GST 和GSH 代償性的發(fā)揮抗氧化作用；消化腺SOD、CAT、GPx、GST 和GSH 均受到誘導(dǎo)。消化腺比鰓的抗氧化能力更強(qiáng)，受到的氧化損傷也更小。另外，對(duì)比各生物標(biāo)志物與對(duì)照組的差異，鰓SOD 和CAT 的敏感性和指示性最強(qiáng)，消化腺CAT 在Cd2+暴露中后期、GSH 在Cd2+暴露中前期的指示性較好，可用作指示水體Cd2+污染的生物標(biāo)志物。