一株酒曲核心酵母的鑒定及產(chǎn)乙酸乙酯條件優(yōu)化

范三紅，馬紅玉，王朝陽，張錦華

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

我國白酒釀造具有悠久的歷史，釀酒與酒曲中微生物的代謝密不可分，酒曲中存在著復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，它們的代謝作用是白酒風(fēng)味物質(zhì)的主要來源。釀酒過程中，乙酸乙酯主要來源于微生物的代謝作用，包括酵母和細(xì)菌，其中，生香酵母是產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的優(yōu)勢菌種，可以利用多種有機(jī)物為原料合成酯類物質(zhì)，代謝為原酒中的香氣成分[1-3]。白酒的香型和香氣等品質(zhì)，一般取決于含有酯類物質(zhì)的種類和濃度。乙酸乙酯是清香型白酒主體香氣的組成成分[4]，并且在酯類物質(zhì)中起著主導(dǎo)作用，其含量的高低還決定著酒的品質(zhì)。較多對乙酸乙酯發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗的報道中發(fā)現(xiàn)，選擇溫度、發(fā)酵pH、酒精度、搖瓶轉(zhuǎn)速和稻殼麩皮等谷物的添加量為試驗因素，乙酸乙酯含量在原酒中可達(dá)1～4 g/L[5-8]。因此，提高乙酸乙酯的含量，對于提高白酒原酒的質(zhì)量具有重要意義。

本研究對酒曲中一株可產(chǎn)香氣成分的核心酵母進(jìn)行了鑒定，并對其產(chǎn)乙酸乙酯條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為白酒風(fēng)味的改善及品質(zhì)的提升提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 供試酒曲核心酵母W-2 由山西省祁縣某酒廠提供。

1.1.2 主要試劑 馬鈴薯、瓊脂、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、乙醇、乙酸乙酯等均為分析純；酵母DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒（Omega Bio-Tek，中國技術(shù)支持中心），引物ITS4，ITS5，6×Loading Buffer，蛋白酶K，溶菌酶瓊脂糖G-10，I 型核酸染色（上海生物工程生物技術(shù)有限公司），Marker（λ DNA/hand III，用于酵母基因組凝膠電泳），100 bp DNA Marker（用于PCR 產(chǎn)物凝膠電泳），2×Taq PCR Mastermix（北京Real-times 生物科技有限公司）等。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3.2 液體YPD 培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL。培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 電子天平JA1203N，上海恒平有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床HRHPY-300，青島海爾特種冰箱柜有限公司；雙定時電泳凝膠儀DYY-6C，北京六一生物科技有限公司；旋渦振蕩儀DY-8C，蘇州凈化設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海Boxun 工貿(mào)有限公司；PCR 熱循環(huán)儀BIO RAD TIOOTM，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；低速離心機(jī)SC-3614 ZONKIA，安徽中科Zonkia 科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱LDX-75KB，北京市六一儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱101-2AB，余姚市東方電工儀器廠；電熱恒溫水浴鍋、通用電爐，天津市大港區(qū)紅杉實驗設(shè)備廠；超潔凈工作臺，AIR TECH Sujing Group Antai Company；全能成像分析系統(tǒng)BioRad，哈爾濱德遠(yuǎn)科技開發(fā)有限公司；氣相色譜儀-2010 ATF，230 V，Shimadzu Corporation 日本島津公司。

1.2 試驗方法

由上述觀點，建構(gòu)主義與人本主義主張以學(xué)生為主體，教師是知識的促進(jìn)者和主導(dǎo)者。這種觀點與任務(wù)驅(qū)動教學(xué)法所蘊(yùn)含的教學(xué)理念相符合，為其實施提供了堅實的理論依據(jù)。

1.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)分析 用三區(qū)劃線法將純化后的W-2 菌株接種到PDA 平板培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置并靜置培養(yǎng)，約3 d 時菌種生長狀態(tài)良好，觀察此時菌種生態(tài)學(xué)特征[8-9]。

1.2.2 W-2 菌種的分子生物學(xué)鑒定 挑取平板上生長狀態(tài)良好的W-2 菌株接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、120 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)20 h，制備菌種種子液，接種于YPD 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)期間對培養(yǎng)液600 nm 處的OD 值進(jìn)行測定，當(dāng)OD 值達(dá)到約1 h 時，用酵母DNA 試劑盒提取基因組，再用0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳（樣品，5 μL；Marker，λDNA/handIII，5 μL；6×Loading buffer，2 μL）。膠回收后，以此基因組作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（25 μL 體系：引物為ITS4：5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′，5 μL；ITS5：5′-GGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG-3′，5 μL；dNTP，Taq DNA聚合酶的混合物和緩沖液，12.5 μL；超純水，2.5 μL；模板，1 μL）。PCR 反應(yīng)條件（體系25 μL）：起始105 ℃；94 ℃保持5 min，94 ℃保持30 s，55 ℃保持30 s，72 ℃保持1.5 min，34 次重復(fù)；72 ℃保持10 min。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳（樣品為PCR 產(chǎn)物，5 μL；100 bp DNA Marker，5 μL）進(jìn)行測試。使用全能成像分析系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行成像分析記錄，并對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，求取反向序列，保留測序結(jié)果中可靠的序列，通過NCBI 進(jìn)行比較，獲得具有更高同源性的已知分類群，然后選取并使用這些序列通過MEGA 5.0 分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7，10-11]。

1.2.3 W-2 菌株產(chǎn)乙酸乙酯條件單因素試驗 保證發(fā)酵條件中其他因素穩(wěn)定，改變其中一個因素，發(fā)酵結(jié)束后，測定體系中乙酸乙酯和乙醇的產(chǎn)量?？疾煸撘蛩貙戤a(chǎn)乙酸乙酯的影響，具體因素和變量及發(fā)酵條件如下[12]。

1.2.3.1 接種量 分別以2%，4%，6%，8%，10%的比例將剛進(jìn)入穩(wěn)定期的種子液接種至50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵3 d，發(fā)酵溫度控制在28 ℃，培養(yǎng)基pH 值為7、含糖量40 g/L。

1.2.3.2 發(fā)酵時間 取4%菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下分別發(fā)酵1，2，3，4，5 d，培養(yǎng)基pH 值為7、含糖量40 g/L。

1.2.3.3 培養(yǎng)基含糖量 取4%菌種接入含糖量分別為30，35，40，45，50 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵2 d，發(fā)酵溫度為28 ℃，培養(yǎng)基pH 值為7。

將所有菌株的OD 值調(diào)整為相同值，吸取菌懸液接種到含有50 mL YPD 培養(yǎng)基的100 mL 錐形瓶中，在28 ℃下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)時間到達(dá)時取出，加入100 mL 40%乙醇溶液并進(jìn)行蒸餾，收集等量的濾液50 mL，濾液通過0.22 μm 濾膜，通過氣相色譜檢測[7]。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株W-2 的發(fā)酵條件 運用Design-Expert 8.05 軟件，以單因素試驗結(jié)果中的因素關(guān)鍵點為基礎(chǔ)，挑選培養(yǎng)基含糖量（X1）、發(fā)酵時間（X2）和接種量（X3）為自變量，以發(fā)酵液中可產(chǎn)生的乙酸乙酯濃度為響應(yīng)值進(jìn)行設(shè)計，于Box-Behnken方法下設(shè)計3 水平試驗方案，并對優(yōu)化出的17 種實驗方案進(jìn)行試驗[15-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 W-2 菌株的形態(tài)學(xué)特征

由圖1 可知，菌種W-2 菌落為直徑1 mm 左右乳白色菌落，圓形，不透明，光滑，邊緣整齊，液體培養(yǎng)有膜，水果香氣，菌體量大時連片生長，菌落表面濕潤，生長后期表面變干，膏狀柔軟，易于挑取。查詢菌種鑒定手冊并對比特征，可確定W-2 具有典型的酵母特征。

2.2 菌株W-2 的分子學(xué)鑒定

在對所提取的酵母基因組進(jìn)行純化回收后，將此基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖2 所示，與Marker、對照酵母相對比，菌株W-2 條帶處于約600 bp 處，清晰明亮且易分辨。

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工成都分公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果為：CGGGCTGTCTACCTGATTTG AGGTCAACTTTTAGTTTATTGTTGTTAAGCCGAGC CTAAAATACTTCTAAACCTGCCTAGCTGATATAAC GAGTTGGAAGAACCTAATACATTATTTCAGAAAG ACTGCTTATTAGTACACTCTTGCTAAGTCAATATT TCAAGTTAACCCTTGACAGAGTATCACTCAATACC AAACCCGAAGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAA ACAGGCATACCCTCTGGAATACCAGAGGGTGCAA TGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAAATCT GCAATTCACAATACGTATCGCATTTCGCTGCGTTC TTCATCGTTGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTG AAAGTTTTGAAGATTTTAATTTTTGTTAAAAATTTT CATGACTATTGGTTAAAGGTTTTAACATTAAAAAA TGTGTTTAGACCTTTGGGCACGCAGCTAGGCTGAT GCACCCAAAGCAAAGTTCAAAAAAACTAGACAA TGTGTGTAAGGTTTATCGCCGCGCAATTAAGCGCT GGCAATAGAATACTATAATGATCCTTCCGCAGGT TCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTAACCTT CCCC。

求取反向序列，并在NCBI 上將其與基因庫中的序列進(jìn)行Blast 比對，結(jié)果顯示，W-2 菌株與Wickerhamomyces anomalus（KY105881.1）的同源性最高，如圖3 所示。利用軟件MEGA 5.0 將W-2 與所挑選的相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4 所示，可確定W-2 為異常威克漢遜酵母。

2.3 菌株W-2 發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的單因素試驗

2.3.1 接種量對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響 發(fā)酵結(jié)果中乙酸乙酯的濃度隨著接種量的變化趨勢如圖5所示，呈先升高后降低，接種量較少時培養(yǎng)液可以產(chǎn)生乙酸乙酯的菌體較少，乙酸乙酯的產(chǎn)量較低，隨接入菌體數(shù)量的增加，乙酸乙酯的產(chǎn)量有所增加，但培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)等菌種的生存條件是有限的，當(dāng)菌體接入到達(dá)一定數(shù)量，菌體便由于營養(yǎng)物質(zhì)不足及產(chǎn)生不利生存的代謝物等原因而保持?jǐn)?shù)量平衡甚至負(fù)增長，此時乙酸乙酯的產(chǎn)量便有所下降；當(dāng)接菌量為4%時，乙酸乙酯的產(chǎn)量最高，為0.379 mg/mL。

2.3.2 含糖量對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響 培養(yǎng)基中糖量對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響見圖6，葡萄糖是菌體生長的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，糖濃度比較低時，養(yǎng)分不足以提供太多菌體的生長，此時乙酸乙酯的生產(chǎn)受到限制，隨著糖濃度增加，提供更多菌體生長的碳源，乙酸乙酯產(chǎn)量隨之增加，當(dāng)糖濃度過高時，由于滲透作用，細(xì)胞生長受到抑制，因此乙酸乙酯產(chǎn)量降低。其中，當(dāng)培養(yǎng)基的含糖量為40 g/L 時，乙酸乙酯產(chǎn)量最高，為0.619 mg/mL。

2.3.3 培養(yǎng)時間對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響 發(fā)酵過程中乙酸乙酯產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間變化呈先增加后降低、最后趨于穩(wěn)定的變化（圖7），隨著培養(yǎng)時間的增長，菌種生長繁殖迅速，代謝速率快，在第2 天乙酸乙酯達(dá)最大值（0.448 mg/mL）；隨后其產(chǎn)量反而下降，推測可能是由于被自身微生物生長所代謝。

對單因素試驗結(jié)果進(jìn)行分析，選取合適的因素區(qū)間，利用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化乙酸乙酯產(chǎn)生條件，進(jìn)行3 因素3 水平（表1）響應(yīng)面試驗設(shè)計（表2）。

表1 因素水平設(shè)計

對表2 進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到模型Y＝0.680＋0.050X1＋0.051X2-4.625E-003X3＋5.750E-003 X1X2＋2.500E-004 X1X3-0.19X12-0.14 X22-0.037X32，對其進(jìn)行統(tǒng)計分析，其結(jié)果列于表3。

從表3 可以看出，自變量含糖量（X1）、發(fā)酵時間（X2）表現(xiàn)為顯著，二次項表現(xiàn)為極顯著，交互作用不明顯，線性關(guān)系顯著，其中，發(fā)酵時間對乙酸乙酯產(chǎn)量的影響最為明顯，其次為培養(yǎng)基中含糖量的多少。F 值越大表明越重要，因素的影響程度大小排序為X2＞X1＞X3，而失擬項是0.452 0，不顯著，證明此響應(yīng)面分析的效果較好，并且R2＝0.989 8，模型的相關(guān)系數(shù)較高，R2adj＝0.976 6，說明該模型可以 對各條件下乙酸乙酯產(chǎn)量的結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。

表2 菌株W-2 試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 分析統(tǒng)計結(jié)果

2.4 響應(yīng)面分析與優(yōu)化結(jié)果

如圖8～10 所示，各因素曲面的陡峭程度相比較，接菌量最平緩，含糖量居中，發(fā)酵時間最陡峭；而等高線相比較，發(fā)酵時間最密集，接菌量最稀疏，因此，幾種發(fā)酵條件中對響應(yīng)值的影響力大小順序為X2＞X1＞X3，即發(fā)酵時間＞含糖量＞接種量。一階偏導(dǎo)結(jié)果為0，得到條件X1＝40.67，X2＝2.184，X3＝3.878%，響應(yīng)值Y＝0.685 mg/mL。因此，得到預(yù)測乙酸乙酯最佳發(fā)酵條件參數(shù)為：含糖量40.67 g/L、發(fā)酵時間2.184 d、接種量3.878%。

2.5 發(fā)酵條件驗證試驗

按照響應(yīng)面分析得到的最佳發(fā)酵條件為試驗方案，試驗條件為發(fā)酵時間2.184 d、含糖量40.67 g/L、接種量3.878%；考慮到實際的可操作性，修正條件為發(fā)酵時間2 d、含糖量41 g/L，接種量4%，在此條件下，發(fā)酵結(jié)束后測定乙酸乙酯平均產(chǎn)量為（0.696±0.047）mg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%，結(jié)果和預(yù)測值比較接近，較優(yōu)化前乙酸乙酯產(chǎn)量提高約20%?？梢?，此響應(yīng)面預(yù)測模型有一定可行性。

3 結(jié)論與討論

本試驗用分子生物學(xué)方法對一株產(chǎn)乙酸乙酯較高的未知酵母W-2 進(jìn)行鑒定，結(jié)果確認(rèn)其為異常威克漢遜酵母，并用響應(yīng)面法對其產(chǎn)乙酸乙酯的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到優(yōu)化條件為發(fā)酵時間40.67 d、含糖量2.184 g/L、接種量3.878%時，在此條件下菌株發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸乙酯的產(chǎn)量為（0.696±0.047）mg/mL，為該酵母運用于酒曲中生產(chǎn)高質(zhì)量白酒提供了理論基礎(chǔ)。由于此菌種自身產(chǎn)乙酸乙酯能力的局限性，并且本研究采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種測定目的酵母的酯化能力，與文獻(xiàn)中所報道的谷物作能源物質(zhì)培養(yǎng)高產(chǎn)乙酸乙酯菌株的產(chǎn)酯能力具有一定差距。黃光建等[20]通過溫度、pH、發(fā)酵底物等因素優(yōu)化酵母產(chǎn)酯條件試驗得到的乙酸乙酯最高產(chǎn)量高達(dá)8.05 mg/mL；侯建光等[14]以稻殼為底物進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明，乙酸乙酯產(chǎn)量高達(dá)13.03 g/kg。對本酵母菌的后續(xù)試驗可以從酵母的培養(yǎng)環(huán)境如培養(yǎng)基選擇多種原料或者從基因工程角度，對菌種進(jìn)行誘變來篩選新型高產(chǎn)菌株。