外周血SEPT9基因甲基化檢測聯(lián)合糖蛋白腫瘤標(biāo)志物在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用

冷 霞 王芳軍 周 培 高 昳 仲芹芹 劉鵬飛* 陳衛(wèi)昌

江蘇省江陰市人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(214400) 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：SEPT9基因甲基化是結(jié)直腸癌的特異性生物標(biāo)志物，測定其外周血表達(dá)水平可評估受檢者結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。目的：初步探討外周血SEPT9基因甲基化檢測聯(lián)合糖蛋白腫瘤標(biāo)志物在結(jié)直腸癌診斷中的臨床意義。方法：納入2016年12月—2017年4月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷的正常對照組57例、腺瘤組61例和結(jié)直腸癌組71例患者，應(yīng)用PCR熒光探針法測定外周血SEPT9基因甲基化情況，測定腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA19-9、CA72-4、CA211水平，采用ROC曲線分析各指標(biāo)診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值。建立Logistic回歸方程，評估SEPT9聯(lián)合CEA診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值。結(jié)果：正常對照組、腺瘤組、結(jié)直腸癌組的SEPT9基因甲基化陽性率分別為0、6.6%、52.1%。結(jié)直腸癌組CEA水平顯著高于正常對照組、腺瘤組(P<0.05)。ROC曲線分析顯示，SEPT9、CEA以及兩者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的AUC分別為0.817、0.707和0.793。Logistic回歸分析顯示，SEPT9、CEA診斷結(jié)直腸癌的OR值分別為1.394(1.198～1.762)、1.325(0.997～1.622)。結(jié)論：隨著疾病進(jìn)展，外周血SEPT9基因甲基化率明顯升高，對結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值較高。聯(lián)合外周血SEPT9基因甲基化和CEA有助于提高結(jié)直腸癌的早期篩查率。

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是我國常見的消化道腫瘤，根據(jù)《中國腫瘤登記年報(bào)》顯示，其發(fā)病率為33.1/10萬，同期死亡率為15.9/10萬，位居惡性腫瘤死亡率的第5位，且發(fā)病率、死亡率正逐年升高[1]。CRC的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后與疾病分期有關(guān)，早期CRC患者的5年生存率可超過90%[2]，但60%～70%的患者在首次確診時(shí)即為中晚期病變。大多數(shù)CRC由結(jié)直腸腺瘤發(fā)展而來，早期發(fā)現(xiàn)并切除腺瘤可明顯降低CRC的發(fā)病率和死亡率[3]，故普及CRC早期篩查和推廣內(nèi)鏡下早診早治具有重要意義。目前結(jié)腸鏡聯(lián)合病理檢查是診斷CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為侵入性操作，充分的腸道準(zhǔn)備、隱私暴露、受檢者本身的恐懼心理等因素限制了其廣泛應(yīng)用于人群篩查。因此，亟需發(fā)展診斷效能高的無創(chuàng)檢查，以提高CRC的早期檢出率。

有研究[4]發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤細(xì)胞DNA釋放，外周血可檢測到SEPT9基因高甲基化，可作為CRC的特異性腫瘤標(biāo)志物，具有較高的敏感性和特異性；SEPT9基因甲基化與CRC分期呈正相關(guān)，而與性別和腫瘤部位無關(guān)。臨床上用于篩查CRC的糖蛋白腫瘤標(biāo)志物包括CEA、CA19-9、CA125、CA72-4等，多項(xiàng)標(biāo)志物聯(lián)合檢測有助于提高診斷CRC的敏感性[5]。此外，血液標(biāo)本易采集，受檢者依從性較高。本研究通過檢測腺瘤、CRC中外周血SEPT9基因甲基化情況和五項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物水平，旨在評估聯(lián)合SEPT9和糖蛋白腫瘤標(biāo)志物對CRC的診斷價(jià)值。

對象與方法

一、研究對象

選取2016年12月—2017年4月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科、普外科就診的196例患者。所有入選者既往均無其他惡性腫瘤病史，未接受過放化療，女性均為非妊娠期。腺瘤和CRC患者經(jīng)結(jié)腸鏡和病理檢查證實(shí)且未接受治療，以結(jié)腸鏡下未見異常者作為正常對照組。入選者均在內(nèi)鏡下治療和外科手術(shù)前采集外周血標(biāo)本。本研究方案通過蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核，所有入組患者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 外周血標(biāo)本采集：使用BD Vacutainer?K2EDTA采血管采集10 mL外周血標(biāo)本，1 350×g離心12 min，提取3.5 mL血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)完成檢測。

2. SEPT9基因甲基化檢測：由南京道奇科技有限公司提供試劑盒(PCR熒光探針法)，并進(jìn)行單盲檢測。按試劑盒說明書操作，主要步驟包括裂解、DNA結(jié)合、DNA洗滌、DNA洗脫、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化、PCR。以β-actin作為內(nèi)參照，行1次PCR，其起峰反應(yīng)循環(huán)數(shù)(Ct)≤閾值(41.0)判定為陽性，高于閾值判定為陰性。

3. 糖蛋白腫瘤標(biāo)志物的檢測：采用電化學(xué)發(fā)光法定量檢測CEA、CA125、CA19-9、CA72-4、CA211，正常上限值(ULN)分別為5.0 ng/mL、35.0 U/mL、37.0 U/mL、8.2 U/mL、2.08 U/mL?！軺LN判定為陽性，

4. 病理檢查：所有病理結(jié)果均由病理科高年資醫(yī)師診斷。有癌變者為CRC組，并根據(jù)內(nèi)鏡檢查、影像學(xué)檢查和術(shù)后病理檢查等結(jié)果，按照AJCC第七版標(biāo)準(zhǔn)，綜合判定臨床分期。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

共納入196例受檢者，標(biāo)本溶血5例，術(shù)后病理檢查證實(shí)為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤2例，故有效樣本共計(jì)189例，其中男性117例，女性72例，平均年齡為(57.75±12.36)歲。正常對照組57名，其中男性31名，女性26名，平均年齡(50.54±12.34)歲；腺瘤組61例，其中男性41例，女性20例，平均年齡(59.77±10.69)歲；CRC組71例，其中男性45例，女性26例，平均年齡(61.79±11.30)歲。

二、外周血SEPT9基因甲基化情況

正常對照組、腺瘤組、CRC組SEPT9基因甲基化陽性率分別為0(0/57)、6.6%(4/61)和52.1%(37/71)。CRC組甲基化陽性率顯著高于正常對照組、腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為39.28、29.71，P<0.01)，而后兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.13，P>0.05)。

三、SEPT9基因甲基化在CRC不同分期中的陽性率

CRC組中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期SEPT9基因甲基化陽性率分別為14.3%(1/7)、40.7%(11/27)、61.5%(16/26)、81.8%(9/11)，不同分期之間甲基化陽性率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.228，P<0.05)(圖1)。

四、腫瘤標(biāo)志物水平

135例受檢者具有完整的CEA、CA125、CA19-9、CA72-4、CA211數(shù)據(jù)，其中正常對照組30例，腺瘤組43例，CRC組62例。正常對照組、腺瘤組各腫瘤標(biāo)志物水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常對照組、腺瘤組CEA水平均顯著低于CRC組(P<0.05)，而CA125、CA72-4均無明顯差異(P>0.05)；正常對照組CA19-9和CA211顯著低于CRC組(P<0.05)，腺瘤組與CRC組無明顯差異(P>0.05)(表1)。

五、診斷CRC的效能

五項(xiàng)糖蛋白腫瘤標(biāo)志物中，CEA對CRC的診斷效能較高(表2)。SEPT9的Ct臨界值為41.43，診斷CRC的敏感性為43.6%，特異性為100%，AUC為0.817；CEA的臨界值為2.96 ng/mL，診斷CRC的敏感性為42.9%，特異性為90.0%，AUC為0.707。SEPT9與CEA的診斷敏感性、特異性相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SEPT9聯(lián)合CEA(任一陽性判定為陽性，兩項(xiàng)均陰性則判定為陰性)診斷CRC的敏感性為79.0%，特異性為86.7%，AUC為0.793(圖2)。

運(yùn)用Logistic回歸建立回歸方程，Y=1/[1+EXP(0.332×SEPT9+0.282×CEA-1.550)]，SEPT9、CEA的OR值分別為1.394(1.198～1.762)、1.325(0.997～1.622)。

討 論

目前已發(fā)現(xiàn)人類共有13個(gè)septin基因，分別命名為SEPT1～SEPT12以及SEPT14，其蛋白產(chǎn)物隔膜蛋白(septins)是一組具有GTP結(jié)合蛋白活性的保守骨架蛋白家族，參與細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞極化、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞膜重構(gòu)等多個(gè)生物學(xué)過程[6]。SEPT9的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在septins八聚體復(fù)合物中位于末端位置，能穩(wěn)定多聚體結(jié)構(gòu)以及促進(jìn)亞基聚合[7]，在子細(xì)胞胞質(zhì)的最終分離中起有重要作用[8]，因此，SEPT9基因的異常表達(dá)可能影響細(xì)胞分裂。Wasserkort等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在CRC組織中可見SEPT9-V2轉(zhuǎn)錄本的CpG島3(CGI3)高甲基化現(xiàn)象，而正常組織中很少見，這成為SEPT9基因甲基化檢測運(yùn)用于CRC篩查的理論基礎(chǔ)。

近年多項(xiàng)研究顯示，SEPT9基因檢測在CRC篩查中的敏感性為67%～75%，特異性為89%～94%，對腺瘤的敏感性為11%～19%，特異性為85%～94%[10-11]。本研究中，SEPT9基因甲基化在CRC中的檢出率為52.1%，腺瘤中的檢出率僅為6.6%。結(jié)果差異可能是由于上述研究多使用Epi proColon 2.0試劑盒，采用1/3或2/3算法(3次PCR中1次或2次為陽性則判定為陽性)，而本研究采用國產(chǎn)試劑盒，將原本3次PCR簡化至1次，雖然減少了檢測成本，但可能在一定程度上降低了檢測精度。吳東等[12]應(yīng)用同種試劑盒發(fā)現(xiàn)診斷CRC的敏感性達(dá)80.0%，特異性為95.3%，但該研究納入的樣本為CRC高危人群，驗(yàn)前概率較高，同時(shí)不能排除地區(qū)差異可能。本研究中，腺瘤組的檢出率為6.6%，與正常對照組相比無明顯差異，提示SEPT9單獨(dú)用于篩查腺瘤的作用有限。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期CRC的SEPT9檢出率顯著高于早期CRC，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[10-11]。隨著CRC病程進(jìn)展，更多的腫瘤細(xì)胞壞死并釋放甲基化SEPT9基因進(jìn)入外周血，導(dǎo)致檢出率升高。

圖1 CRC不同分期中SEPT9基因甲基化的陽性率

圖2 SEPT9、CEA以及兩者聯(lián)合診斷CRC的ROC曲線

表1 三組各腫瘤標(biāo)志物水平[M(P25，P75)]

*正常對照組與腺瘤組比較；#腺瘤組與CRC組比較；▲正常對照組與CRC組比較

表2 各腫瘤標(biāo)志物診斷CRC的效能(%)

*任一項(xiàng)腫瘤指標(biāo)陽性判定為陽性，五項(xiàng)均陰性判定為陰性

本研究中，五項(xiàng)腫瘤指標(biāo)聯(lián)合診斷CRC的敏感性為72.6%，特異性為70.0%。糖蛋白腫瘤標(biāo)志物在多種消化系統(tǒng)惡性腫瘤中不同程度升高，對CRC的特異性較差，但血液標(biāo)本易采集，檢測方法便捷，受試者接受程度較高，較適用于大樣本人群普查。五項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物中，僅CEA水平在CRC組與正常對照組、腺瘤組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CEA診斷CRC的敏感性為42.9%，特異性為90.0%，與SEPT9基因甲基化相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但吸煙[13]、潰瘍性結(jié)腸炎[14]、自身免疫性疾病[15]等亦可引起CEA水平升高，而SEPT9基因甲基化結(jié)果不受年齡、性別、腫瘤部位等因素的影響[4]。兩者聯(lián)合診斷CRC的敏感性可提升至79.0%，特異性仍維持在85%以上。ROC曲線示SEPT9、CEA的AUC分別為0.817、0.707，兩者聯(lián)合的AUC為0.793，略低于單獨(dú)SEPT9。因此，在CRC高危人群中應(yīng)用SEPT9聯(lián)合CEA檢查，有利于下一步篩查方法的選擇，提高受試者對結(jié)腸鏡的依從性。

本研究尚有不足之處，首先未比較SEPT9基因甲基化情況在不同臨床特征CRC組之間是否存在差異，如病理分化、侵襲程度等；其次糞便隱血試驗(yàn)作為CRC序貫篩查的重要環(huán)節(jié)，本研究未收集入選者的相關(guān)結(jié)果；最后，僅135例患者具有完整的SEPT9、五項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物資料，未能分析所有入組患者的資料。

綜上所述，外周血SEPT9基因甲基化檢測為無創(chuàng)性檢查，其檢出率與CRC病程進(jìn)展呈正相關(guān)，在CRC診斷中具有較高的敏感性和特異性，但其對腺瘤的診斷價(jià)值有限。在人群篩查中聯(lián)合應(yīng)用SEPT9基因甲基化和CEA檢測，有助于受試者進(jìn)一步接受結(jié)腸鏡檢查，從而提高CRC的早期篩查率。