屠宰養(yǎng)殖企業(yè)利用LAMP方法快速非洲豬瘟與實驗室操作注意事項

楊軍　劉金森　郝禎燕　王霞　王力強

非洲豬瘟病毒傳染性強，死亡率幾乎達到100%，目前還沒有可用于預防和治療的疫苗。1921年于非洲東部肯亞確認。1957年傳出非洲，進入西班牙。在2007年開始進入俄羅斯境內(nèi)，2017年3月，俄羅斯伊爾庫茨克爆發(fā)非洲豬瘟疫情，該病由此從中東歐地區(qū)傳播至俄羅斯東部，距離中國邊界僅1000公里，威脅亞洲。2018年8月，我國發(fā)生了首例非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）的感染，這是我國首次發(fā)生非洲豬瘟疫情，截至2019年4月19日，全中國大陸31個省市自治區(qū)都傳出豬瘟疫情。非洲豬瘟是一種高度接觸性傳染病，該病屬于世界動物衛(wèi)生組織的法定報告動物疫病。目前，尚無有效的非洲豬瘟疫苗和治療方法。因此，在屠宰養(yǎng)殖企業(yè)快速準確鑒定非洲豬瘟成為迫切需求。本文將對屠宰養(yǎng)殖企業(yè)利用LAMP方法快速非洲豬瘟與實驗室操作注意事進行闡述。

非洲豬瘟對我國的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的打擊是非常沉重的，現(xiàn)在迫切的需要一套切實可行的防止辦法，定期的在豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的豬抽樣檢查是很有必要的，及時發(fā)現(xiàn)傳染源，切斷傳播途徑，可以避免財產(chǎn)損失，環(huán)介導等溫擴增反應LAMP方法由于其簡單快速準確特點，適用于我國的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)鑒定篩查非洲豬瘟病毒。

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）由非洲豬瘟病毒引起的豬急性烈性傳染病，由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染，其屬非洲豬瘟病毒科，具有彩虹病毒的外觀，痘病毒的內(nèi)涵。該病毒是一種二十面體對稱，帶囊膜的雙鏈DNA病毒，直徑172～220nm，似六角形，基因組全長170kd，核苷酸序列已全部測定，含有151個開放性閱讀框，5個多基因家族編碼200多種蛋白，其中113種病毒蛋白的結構和功能已經(jīng)清楚，32種為結合蛋白。病毒粒子含有至少28種結構蛋白，在感染細胞內(nèi)有100種以上的病毒誘導蛋白，至少有50種能與感染豬或康復豬的血清反應。根據(jù)單抗分析結果表明，抗原變異主要發(fā)生于結構蛋白P150、P14、P12。標準的免疫學試驗不能區(qū)分病毒株，但根據(jù)限制性內(nèi)切酶分析能將病毒株區(qū)別，并分為不同基因型。

自然感染和人工感染此病毒均不產(chǎn)生型的中和抗體，究其原因，可能與免疫組織的損傷、病毒基因組的遺傳變異、抗原競爭、免疫抑制、免疫逃避等有關。非洲豬瘟病毒對溫度和酸的抵抗能力很強，室溫干燥或冰凍數(shù)年仍存活，室溫中經(jīng)18個月仍能從血液和血清中分離出病毒。對高熱敏感，在60℃經(jīng)30min即死亡。對許多脂溶劑和常用消毒劑敏感。

日本學者Notomi等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導等溫擴增反應（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP），其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA poLymerase）在等溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，基因的擴增和產(chǎn)物的檢測可一步完成。

2019年1月4日中國動物疫病預防控制中心發(fā)布了《關于公布第一批非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測試劑評價結果的通知》，由國檢驗檢疫科學院研發(fā)、北京森康生物技術開發(fā)有限公司生產(chǎn)的“非洲豬瘟病毒LAMP檢測試劑盒”成功入圍，這也是本次非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測試劑評價中唯一入圍的“核酸等溫擴增類”檢測試劑。

LAMP試劑盒診斷敏感性100%、診斷特異性100%、不需要特殊儀器、快速、結果判定簡單，是屠宰養(yǎng)殖企業(yè)鑒定非洲豬瘟病毒的優(yōu)選策略。

一、材料與方法

1、血液樣本采集

實驗人員事先消毒后，使用無菌的采血器對抽樣選取的豬進行口腔靜脈取血（圖1）。血液低溫4℃保存不超過24h，若需長期存放，需放置-80℃冰箱，盡量避免反復凍融（不超過3次）。

2、血液樣本處理

取血液樣本2ul，將10ul的PBS（PH7.2，含有1萬單位青霉素和1萬單位鏈霉素）均勻之混合，靜置70℃，30min后滅活，3000r/min，4℃離心5min，取上清液，編號備用。

3、LAMP擴增步驟

①反應預混液配置（配置和分裝在冰上進行）

每個樣本配置16ul LAMP buffer，5.5ul引物液，0.5ulCMR染料，1.0ulBST酶，總反應液應比全部樣本個數(shù)另外多加3例樣本的體積。

②反應預混液分裝

將配置的反應預混液渦旋均勻，瞬時離心后，按每管23ul分裝與LAMP管內(nèi)。

③加樣

向對應LAMP管加入上述處理的血液樣品20ul。同時，向陽性對照管內(nèi)加入20ul陽性對照，向陰性對照管內(nèi)20ul DEPC水。

④加入礦物油

向每管加入礦物油20ul，蓋緊管蓋，瞬時離心，轉移至檢測區(qū)。

⑤檢測

將離心后的LAMP管放入檢測儀內(nèi)，設定好檢測樣品（S）、陽性對照（PC）、陰性對照的（NC）的位置，反應參數(shù)設置：采用64℃ 60min，每1min采集一次FAM通道熒光信號，共60個循環(huán)。

二、結果與分析

LAMP反應結果，由圖2可見，左側編號為4號為陽性對照，2號為陰性對照。有結果可以看出所有樣品均沒有感染非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）。

三、討論

非洲豬瘟疫情迅猛，屠宰養(yǎng)殖企業(yè)為了有效避免財產(chǎn)損失，及時發(fā)現(xiàn)傳染源，終止疫情傳播，是迫切手段，也是必要手段。太高的靈敏度使得其比普通PCR擴增更加容易污染導致假陽性。因此，必須高度重視擴增產(chǎn)物的污染。常規(guī)措施包括嚴格的實驗分區(qū)、添加UNG和dUTP（可能導致反應效率下降）、使用熒光定量等不開蓋檢測方法。實驗室一旦遭到污染，所有相關試劑必須全部更換，必要時還得更換實驗室。本文針對屠宰養(yǎng)殖企業(yè)小型實驗室操作注意事項做出如下總結：

1、實驗室試劑嚴格按要求低溫存放，避免污染;

2、采血器保證無菌，實驗環(huán)境無菌，實驗室定期紫外殺菌照射;

3、抽樣的樣本數(shù)量選取分群隨機抽樣辦法，符合統(tǒng)計學原理，具有代表性;

4、實驗結果記錄，存檔;

5、實驗結束后，切記不要打開反應管，避免造成環(huán)境污染，按照實驗試劑按照廢液處理。

由于屠宰企業(yè)中豬數(shù)量龐大，在抽樣時因注意選取數(shù)據(jù)量小的樣本反映大的總體研究特性，誤差范圍在可以接受范圍內(nèi)。基于張志誠提出的基于地理學第一定律在疫病風險管理和控制中風險鄰近概念，即在空間和時間上鄰近的事件對與其相鄰的空間單元和時間單元的風險影響要遠大于較遠的空間和時間單元的影響權重，建議采用分群隨機抽樣辦法，例如對從外地引進的豬和本地豬分開成兩個獨立的群體，獨立抽樣，例外，成年與否、性別甚至是不同的品種也可以加權考慮在內(nèi)，盡量做到滿足代表性的原則。

此外，屠宰企業(yè)中對場地和設施的消毒也是避免感染的重要的一環(huán)，對豬舍定時清潔，及時定期的消毒，對糞便等污物作化學處理后采用深埋、堆積發(fā)酵或焚燒等方式處理。對辦公、飼養(yǎng)人員的宿舍、公共食堂等場所，可采用噴灑方式消毒。對消毒產(chǎn)生的污水應進行無害化處理。飼養(yǎng)管理人員可采取淋浴消毒。對衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高壓滅菌等方式消毒。

最后，LAMP鑒定非洲豬瘟方法已經(jīng)在一些屠宰養(yǎng)殖企業(yè)加以利用，可以快速準確的鑒定非洲豬瘟，盡可能的保障人民和企業(yè)的財產(chǎn)安全。希望屠宰養(yǎng)殖企業(yè)能規(guī)范養(yǎng)殖和屠宰操作，防患非洲豬瘟與未然。

總之，非洲豬瘟對我國的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的打擊是非常沉重的，定期的在豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)的豬抽樣檢查是很有必要的，及時發(fā)現(xiàn)傳染源，切斷傳播途徑，可以避免財產(chǎn)損失，經(jīng)試驗證明，環(huán)介導等溫擴增反應LAMP方法由于其簡單快速準確特點，適用于我國的豬屠宰養(yǎng)殖企業(yè)鑒定篩查非洲豬瘟病毒。

（作者單位：015000內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督管理所）