反復(fù)植入失敗與子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物研究進(jìn)展

牛凱迪，王春雪，于月新

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平分院生殖醫(yī)學(xué)中心，沈陽 110003)

反復(fù)植入失敗(RIF)的原因包括母體因素和胚胎因素，母體因素所致RIF占絕大部分，包括子宮內(nèi)膜病理、激素或代謝紊亂、免疫因素等，其中子宮內(nèi)膜容受性異常是植入失敗的主要原因。成功胚胎植入的前提首先是類固醇激素和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的血管通透性，然后將特定的免疫細(xì)胞群招募到植入部位[1]，中間任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯(cuò)就會(huì)導(dǎo)致胚胎植入失敗。通過研究反復(fù)植入失敗的分子機(jī)制，為進(jìn)一步提高子宮內(nèi)膜容受性找到解決辦法，有利于胚胎植入。本文主要針對RIF和子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子如粘附因子、非編碼RNA和免疫細(xì)胞進(jìn)行綜述。

一、粘附因子與子宮內(nèi)膜容受性

1.血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子(PECAM1)：PECAM1位于子宮內(nèi)膜組織的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。PECAM1和同源框基因A10(HOXA10)一樣，蛋白表達(dá)水平在增殖后期開始增加，分泌中期達(dá)到峰值[2]，進(jìn)一步證實(shí)PECAM1可以作為子宮內(nèi)膜容受性的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)RIF組PECAM1 mRNA和蛋白水平明顯低于對照組[2]；PECAM1通過其下游轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)調(diào)控子宮內(nèi)膜，影響胚胎植入，可用于開發(fā)RIF潛在治療方法。

2.Krüppel樣因子12(KLF12)：KLF12屬于KLF家族中鋅指轉(zhuǎn)錄因子，是由孕酮控制的下游基因[3]，可以負(fù)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化[4]。RIF可能與KLF12相關(guān)，Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)分泌中期RIF患者子宮內(nèi)膜樣本中異常表達(dá)KLF12。KLF12還可以抑制體外培養(yǎng)的Ishikawa細(xì)胞(高分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系)白血病抑制因子(LIF)的表達(dá)，在人類子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)了類似反應(yīng)，KLF12可能通過抑制LIF來降低胚胎的粘附能力[3]。用人重組的LIF治療富含KLF12的Ishikawa細(xì)胞，可以提高胚胎粘附率[3]，降低KLF12是否會(huì)提高胚胎移植成功率有待進(jìn)一步研究。

3.黏蛋白1(MUC1)：MUC1在管腔和腺上皮高度表達(dá)，可以抑制囊胚植入附著期起重要作用的黏附因子的表達(dá)。在植入窗口期，MUC1降低到相對較低的水平，進(jìn)而使得胚胎和子宮內(nèi)膜相容受。而在RIF女性中，MUC1水平極低。研究也證實(shí)了在RIF患者血液和子宮內(nèi)膜中MUC1含量顯著低于有生育能力的對照組女性[6]。子宮內(nèi)膜MUC1表達(dá)是選擇和植入活性高、質(zhì)量好的囊胚所必需的[7]。因此，MUC1的大幅度減少可能破壞子宮內(nèi)膜的胚胎選擇，無法維持正常妊娠。MUC1作為一種免疫調(diào)節(jié)劑來防御外來物質(zhì)并保護(hù)植入胚胎[8]，其含量極度減少降低了這種保護(hù)作用，使胚胎易受攻擊。MUC1不受人口學(xué)和臨床特征影響，是一項(xiàng)獨(dú)立檢測子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志[9]。由于MUC1在內(nèi)膜組織和血液中有高度相關(guān)性，因此可以通過無創(chuàng)檢測外周血MUC1的表達(dá)來評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性[6]。

二、非編碼RNA與子宮內(nèi)膜容受性

隨著微陣列和高通量測序的出現(xiàn)，表觀遺傳對子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控更多地得到了證實(shí)[10]。檢測子宮內(nèi)膜RNA水平，可評(píng)估進(jìn)而提高子宮內(nèi)膜容受性。

1.長鏈非編碼RNA(lncRNA)：lncRNA是一種長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。lncRNA幾乎參與人類生物學(xué)所有方面，從染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、修飾、轉(zhuǎn)錄、翻譯，到細(xì)胞分化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞周期調(diào)控等方面[11]，它通過激活基因增強(qiáng)子和修飾染色質(zhì)復(fù)合物來控制基因表達(dá)。由于lncRNA對子宮內(nèi)膜作用還不明確，只能通過與mRNA共表達(dá)來間接推斷其功能。lncRNA及其蛋白編碼共表達(dá)基因聚集在數(shù)百條通路上，其中一些是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵通路，如Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路和B細(xì)胞抗原受體(BCR)信號(hào)通路。因此，這些lncRNA大多數(shù)被預(yù)測參與多種途徑，在子宮內(nèi)膜容受性上發(fā)揮著重要作用。對分泌中期子宮內(nèi)膜進(jìn)行微陣列研究，可以得到RIF患者和對照組相應(yīng)的lncRNA[10]，并進(jìn)行個(gè)性化子宮內(nèi)膜容受性診斷。由于一些lncRNA在外周血中保持穩(wěn)定，并受到內(nèi)源性核糖核酸酶保護(hù)，因此可以作為診斷和檢測的生物標(biāo)志物[12]。

2.微小核糖核酸(microRNA)：microRNA是具有20到30個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA[13]，它能靶向阻斷mRNA翻譯或選擇mRNA進(jìn)行降解，抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)[14]，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育及表觀遺傳。在子宮內(nèi)膜的周期性變化情況下，多種microRNA調(diào)控上皮細(xì)胞的增殖和分化，從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性[15]。通過微陣列檢測RIF患者和對照組差異表達(dá)的microRNA，進(jìn)一步得到靶基因和通路，從而進(jìn)行相應(yīng)靶點(diǎn)治療。miR-145可以降低子宮內(nèi)膜上皮的胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)蛋白水平，減少胚胎粘附，RIF患者miR-145含量明顯高于對照組，子宮內(nèi)膜miR-145抑制療法可能會(huì)提高RIF患者的移植率[16]。

3.環(huán)狀RNA：環(huán)狀RNA是一種特殊類型的內(nèi)源性非編碼RNA，屬于共價(jià)閉環(huán)，有較高的穩(wěn)定性和組織特異性，比其他RNA更適合作為生物標(biāo)志物[17]。環(huán)狀RNA以microRNA為靶點(diǎn)調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮其功能。用基因芯片檢測RIF患者和有生育能力的女性，發(fā)現(xiàn)在RIF患者中有7個(gè)環(huán)狀RNA上調(diào)[18]。但目前環(huán)狀RNA如何在子宮內(nèi)膜容受性中發(fā)揮作用仍在研究中。

三、基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜容受性

基因多態(tài)性經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，它的發(fā)生可能是由于基因組中重復(fù)拷貝數(shù)的不同，也可能是單拷貝序列的變異，或者等位基因的轉(zhuǎn)換或替換。

1.亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)：MTHFR基因位于1號(hào)染色體的短臂上，由11個(gè)外顯子組成，對細(xì)胞分裂、胚胎發(fā)育和早期妊娠有重要作用。MTHFR基因最常見的兩種多態(tài)性MTHFR 1298A>C(rs18001131)和MTHFR 677C>T(rs18001133)[19]，可以作為評(píng)估胚胎能力的新生物標(biāo)志物，增加篩選出可以妊娠的胚胎的可能性[20]。母體血管血栓的形成，可能會(huì)減少絨毛間隙的灌注，導(dǎo)致胎盤形成失敗，MTHFR純合或雜合基因突變導(dǎo)致酶活性降低，同型半胱氨酸累積[21]，更容易發(fā)生血栓。MTHFR是葉酸代謝的重要酶，可以通過母體膳食的補(bǔ)充來支持依賴MTHFR的細(xì)胞通路，甚至可以在進(jìn)行輔助生殖技術(shù)的胚胎培養(yǎng)基加入葉酸[20]，這可能促進(jìn)胚胎植入，減少RIF發(fā)生。

2.核因子κB(NF-κB)多態(tài)性：NF-κB調(diào)節(jié)細(xì)胞生理學(xué)許多方面如免疫、炎癥、細(xì)胞生存等[22]。NF-κB1和NF-κB p65是NF-κB的兩個(gè)關(guān)鍵二聚體。NF-κB1 94ins/del AGGT(rs2836249)是唯一已知功能的基因多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，RIF患者攜帶rs2836249缺失的等位基因頻率更高(P<0.01)[23]。NF-κB蛋白質(zhì)表達(dá)障礙可能造成子宮內(nèi)膜容受性降低，進(jìn)而導(dǎo)致RIF。

四、免疫細(xì)胞與子宮內(nèi)膜容受性

免疫細(xì)胞在子宮內(nèi)膜容受性發(fā)揮著重要作用，成功植入及妊娠需要免疫平衡，這其中調(diào)控的關(guān)鍵元件是樹突細(xì)胞和調(diào)節(jié)T細(xì)胞[24]。

1.調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)：胚胎植入和腫瘤發(fā)生在行為和機(jī)制上有很多相似之處，調(diào)節(jié)T細(xì)胞作為抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要抑制因子，對腫瘤血管生成有重要的直接作用[25]，推測其能影響子宮內(nèi)膜容受性。

調(diào)節(jié)T細(xì)胞廣泛分布在外周血循環(huán)和組織中，趨化因子-趨化因子受體誘導(dǎo)的細(xì)胞控制著它們的分布。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志性分子。Diao等[26]的研究顯示，與對照組相比，RIF患者內(nèi)膜Foxp3+Tregs顯著降低；用流式細(xì)胞術(shù)分析了外周foxp3+T細(xì)胞的趨化因子受體3(CXCR3)、趨化因子CC類受體4(CCR4)、趨化因子CC類受體6(CCR6)和趨化因子CC類受體7(CCR7)的表達(dá)，在對照組和RIF組中CXCR3、CCR6、CCR7表達(dá)無顯著差異，CCR4表達(dá)有顯著差異，這一結(jié)果表明，有RIF女性外周Tregs細(xì)胞的趨化傾向發(fā)生了改變。

CD4+CD25+T細(xì)胞是自然存在的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，在維持機(jī)體對自身抗原耐受中扮演重要角色。小鼠相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞抑制了雄性特異性組織相容性(male specific minor histocompatibility，H-Y)抗原對胎兒的母體免疫反應(yīng)[27]，而在人類的研究中又發(fā)現(xiàn)正常妊娠與循環(huán)淋巴細(xì)胞群中CD4+T細(xì)胞、CD25+T細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)。此外，體外受精-胚胎移植患者外周血中高比例Tregs與更好的妊娠結(jié)局呈正相關(guān)。

2.免疫相關(guān)因子和子宮自然殺傷細(xì)胞：腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like apoptosis weak inducible factor，TWEAK)是腫瘤壞死因子(TNF)配體超家族的細(xì)胞因子，由多種白細(xì)胞(單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、子宮自然殺傷細(xì)胞等)組成，TWEAK與成纖維細(xì)胞因子誘導(dǎo)基因(fibroblast factor inducible gene，F(xiàn)n14)受體結(jié)合可以防止局部細(xì)胞毒性，促進(jìn)人子宮內(nèi)膜血管生成及構(gòu)建免疫營養(yǎng)通路[24]。子宮內(nèi)膜在著床期時(shí)局部免疫由Th1轉(zhuǎn)變成Th2，在此期間65%～70%的免疫細(xì)胞為自然殺傷(NK)細(xì)胞，其標(biāo)志物為CD56。子宮NK細(xì)胞在正常情況下不會(huì)自發(fā)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，在高Th1環(huán)境下，NK細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲有殺傷毒性[28]。

RIF患者體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量異常，并且白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)等細(xì)胞因子表達(dá)失調(diào)。IL-15促進(jìn)Tregs和NK細(xì)胞增殖。IL-18屬于前炎癥因子，研究中表明著床是炎癥過程，其特征是大量的生長因子和細(xì)胞因子分泌[29]。IL-15、IL-18共同促進(jìn)Th2生成，下調(diào)炎癥和細(xì)胞毒性通路，進(jìn)而影響螺旋動(dòng)脈蛻膜化[28]。然而，過高的IL-15、IL-18會(huì)使Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門h1細(xì)胞，引起RIF免疫過度激活，同樣不利于胚胎植入。通過測量IL-18/TWEAK mRNA比率來記錄局部細(xì)胞毒性/血管生成平衡，IL-15/Fn-14 mRNA比率用于評(píng)估子宮NK細(xì)胞的活化和成熟狀態(tài)，而CD56+細(xì)胞計(jì)數(shù)同時(shí)測量它們在子宮內(nèi)膜的相對含量[28]。植入前測量IL-15、IL-18、CD56可以方便制定下一步治療方案，進(jìn)而對患者進(jìn)行個(gè)性化胚胎移植，糖皮質(zhì)激素治療子宮內(nèi)膜過度激活，而黃體支持和子宮內(nèi)膜局部損傷相關(guān)治療策略適合治療子宮內(nèi)膜活化低的女性[28]。

五、總結(jié)

子宮內(nèi)膜容受性是一個(gè)復(fù)雜過程，涉及到多種細(xì)胞因子、粘附因子、母體基因多態(tài)性及免疫狀況等方面。胚胎植入成功需要足夠的母體免疫誘導(dǎo)微環(huán)境，來保護(hù)半異基因胎兒免受母體免疫排斥[30]。子宮內(nèi)膜因子和母體基因多態(tài)性可以作為潛在的生物標(biāo)志物，來判斷子宮內(nèi)膜容受性狀況，并進(jìn)行下一步的相應(yīng)治療。本文只是列舉了幾個(gè)與RIF相關(guān)的因子，仍有許多因子未發(fā)現(xiàn)或正在研究。