抑制PRR11基因?qū)σ认侔┘?xì)胞SW1990行為的影響

李慧娟 張 黎 姜 姍 劉 淼 干銀弟 李 青

(湖北省第三人民醫(yī)院，武漢430010)

胰腺癌(Pancreatic carcinoma)是胰腺外分泌癌，是世界上最致命的癌癥之一[1]，目前其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)均有增多的趨勢(shì)，且胰腺癌早期癥狀不明顯，發(fā)病隱匿，診斷困難。在胰腺癌的治療上，除手術(shù)以外，目前沒有更有效的方式可以改善。以傳統(tǒng)的放療和化療手段治療胰腺癌效果不明顯，而且使用化療藥物對(duì)胰腺癌進(jìn)行治療存在化療抵抗性、遠(yuǎn)期高復(fù)發(fā)率等難題。如果不能在早期手術(shù)切除病灶，胰腺癌的中位生存時(shí)間只有8個(gè)月左右[2]。研究顯示，胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展與癌基因異常激活、抑癌基因失活以及DNA修復(fù)機(jī)制異常等存在密切聯(lián)系[3,4]。PRR11信號(hào)通路和癌癥的發(fā)展存在密切關(guān)系，Proline-rich protein 11(PRR11)在胃癌、直腸癌、肺癌等組織或者相關(guān)癌細(xì)胞中均表達(dá)上升[5-7]，但其與胰腺癌的關(guān)系尚不明確。本研究以胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討PRR11與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 67例胰腺癌組織和胰腺癌旁組織樣本均來自本院住院部自2015年11月至2016年4月的胰腺癌患者，平均年齡(57.11±3.32)歲，其中男34例，女33例。經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌，術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療或生物治療，具有完整的病例資料。胰腺癌旁組織作為對(duì)照。羊抗人PRR11單克隆抗體 和兔抗羊二抗購(gòu)于Abcam公司。

1.2方法

1.2.1PCR檢測(cè)PRR11的表達(dá) 用TaKaRa 公司TRI Reagent?提取組織總RNA。使用TaKaRa 公司 Premix Ex TaqTMHot Start Version 擴(kuò)增PRR11片段，采用優(yōu)晶公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒Ⅱ進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，以純化后的PCR產(chǎn)物作為模板，使用美國(guó) ABI 公司的 BigDyeTerminator v3.1試劑盒進(jìn)行PCR測(cè)序反應(yīng)。

1.2.2免疫組化檢測(cè)PRR11的表達(dá) 組織標(biāo)本用10%的中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，烘干，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，高溫高壓檸檬酸抗原修復(fù)3 min，雙氧水孵育10 min，PBS沖洗3次，血清封閉15 min，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗孵育，PBS 沖洗3次，DAB 顯色劑顯色，充分沖洗，鹽酸酒精分化，封片后觀察。結(jié)合染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行評(píng)分，其中染色程度0分=不著色陰性，1分=淺黃色，2分=棕黃色，3分=黃褐色；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0分：陽(yáng)性細(xì)胞<10%，1分：10%<陽(yáng)性細(xì)胞<50%，2分：50%<陽(yáng)性細(xì)胞<75%，3分：陽(yáng)性細(xì)胞>75%。染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目?jī)身?xiàng)得分相乘作為最后的評(píng)分，將評(píng)分≤3分視為陰性，>3分視為陽(yáng)性，評(píng)分越高表明含量越高。

1.2.3胰腺癌細(xì)胞的篩選 CFPAC-1、PATU8988、SW1990、PANC-1共4種胰腺癌細(xì)胞均來自創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以RT-PCR的方法檢測(cè)PRR11在4種細(xì)胞中的表達(dá)，比較其表達(dá)水平。

1.2.4PRR11對(duì)SW1990的影響 將SW1990細(xì)胞分為對(duì)照組、敲減PRR11空載組(siRNA-NC組)、敲減PRR11組(siRNA-PRR11組)。

根據(jù)siRNA靶序列篩選設(shè)計(jì)原則，結(jié)合分析PRR11的基因序列，以Ambion公司siRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng)，選擇確定1條特異性siRNA靶序列，然后設(shè)計(jì)合成寡核苷酸的正義鏈和反義鏈。將合成的寡核苷酸片段的正義鏈和反義鏈進(jìn)行退火處理。即先將其分別溶于雙蒸水中，等摩爾數(shù)混合后90℃加熱 3 min，自然降溫至37℃后，形成雙鏈的寡核苷酸。將合成的發(fā)卡siRNA插入經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的siRNA表達(dá)載體pSilencer 2．1-U6neo中，成功構(gòu)建抑制PRR11表達(dá)的siRNA重組質(zhì)粒。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因 選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，復(fù)氧2 h后收集細(xì)胞，用Trizol法提取各組總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR引物經(jīng)Primer6.0軟件設(shè)計(jì)。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(BCL2)：上游 5′-TGAACTGGGGGAGGATTGTG-3′，下游 5′-TTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3′；Caspase 3：上游 5′-GGCGCTCTGGTTTTCGTTAATA-3′，下游 5′-GCTGCATCGACATCTGTACC-3′；PRR11：上游：5′-CCATCTCGTATCTGCCACCG-3′，下游 5′-AGTGCT-TTAGCGAGACTGGG-3′。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析。

1.2.6CCK-8檢測(cè)增殖 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SW1990細(xì)胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到5×103個(gè)/100 μl，種入96孔板，每孔100 μl細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白組，37℃培養(yǎng)過夜(在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μl無菌PBS)；每組5個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24 h；每孔加入100 μl含10%CCK-8的PBS溶液，37℃培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光值OD。

1.2.7Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 胰蛋白酶消化并收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用PBS洗2遍，無血清的DF-12培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105ml-1。均勻加入400 μl 細(xì)胞懸液至上室，實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為8、16和32 μg/ml，對(duì)照組不加藥；下室加入含10%FBS的DF-12培養(yǎng)基600 μl，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出上室，用棉簽擦去上室細(xì)胞，多聚甲醛固定15 min，棄固定液，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，PBS洗3遍，顯微鏡下攝片并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1PRR11在胰腺癌組織中的表達(dá) 如圖1所示，根據(jù)PRR11免疫組化的結(jié)果，可見癌旁組織的染色程度得分為0分，經(jīng)過計(jì)數(shù)可得陽(yáng)性細(xì)胞得分為0分，為PRR11陰性。胰腺癌組織免疫組化結(jié)果中呈現(xiàn)黃棕色，染色程度得分為3分，經(jīng)過計(jì)數(shù)可得陽(yáng)性細(xì)胞得分為2分，總得分為6分，為PRR11陽(yáng)性。PRR11在癌旁組織的表達(dá)顯著低于胰腺癌組織(P<0.05)。

2.2胰腺癌細(xì)胞的篩選 檢測(cè)PRR11在CFPAC-1、PATU8988、SW1990、PANC-1共4種胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示PRR11在SW1990的表達(dá)最高，顯著高于CFPAC-1、PATU8988、PANC-1(P<0.05)。因此，SW1990比較適合作為PRR11的研究對(duì)象。見圖2。

2.3PRR11對(duì)SW1990的影響

2.3.1PRR11在SW1990中的表達(dá) 檢測(cè)PRR11在SW1990中的表達(dá)， 結(jié)果顯示PRR11在si-PRR11組的表達(dá)顯著低于對(duì)照組和si-NC組(P<0.05)。對(duì)照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。見圖3。

圖1 PRR11在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

Fig.1 Expression of PRR11 in pancreatic cancer and adjacent tissues

Note: A.The expression of PRR11 in paracancerons tissues;B.The expression of PRR11 in pancreatic cancer.

圖2 胰腺癌細(xì)胞的篩選Fig.2 Screening of pancreatic cancer cellsNote: *.P<0.05.

圖3 PRR11在SW1990中的表達(dá)Fig.3 Expression of PRR11 in SW1990 cellsNote: *.P<0.05.

2.3.2PRR11對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響 SW1990細(xì)胞的生存曲線見圖4。與si-NC組比較，si-PRR11組細(xì)胞的增殖在24 h和72 h均顯著增加(P<0.05)。對(duì)照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.3.3凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 檢測(cè)Caspase 3、BCL2在SW1990細(xì)胞不同處理組的表達(dá)，見圖5。與對(duì)照組比較，Caspase 3在si-PRR11組的表達(dá)顯著升高，BCL2顯著降低(P<0.05)。對(duì)照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 SW1990細(xì)胞的增殖曲線Fig.4 Proliferation curve of SW1990 cells

圖5 凋亡相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 Expression of apoptosis related genesNote: *.P<0.05.

圖6 PRR11對(duì)SW1990的遷移的影響Fig.6 Impact of PRR11 on migration of SW1990Note: A.The control group;B.The si-NC group;C.The si-PRR11 group；D.The statistical chart of cell migration.*.P<0.05.

2.3.4Transwell檢測(cè)遷移 與對(duì)照組比較，si-PRR11組SW1990細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.05)。對(duì)照組和si-NC組沒有顯著性差異(P>0.05)。見圖6。

3 討論

胰腺癌的惡性程度高，早期易發(fā)生侵襲和遷移，預(yù)后較差。根據(jù)全球的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，5年內(nèi)的生存率僅有4%，胰腺癌已經(jīng)成為危害人類健康的重要疾病之一[8,9]。在我國(guó)，胰腺癌的病發(fā)率也逐漸增加，而且臨床確診后，大多數(shù)患者已經(jīng)錯(cuò)失根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)。而能行根治性手術(shù)的患者又有較高的復(fù)發(fā)率或者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能[10]。胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展是個(gè)極其復(fù)雜的生物過程，其中受到多種因素和多個(gè)基因的調(diào)控。有學(xué)者指出，惡性腫瘤難以治愈的根本原因在于腫瘤細(xì)胞的無限增殖，其無限增殖則是基于細(xì)胞周期的調(diào)控發(fā)生紊亂，PRR11是調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期的相關(guān)基因，位于染色體17q23的擴(kuò)增區(qū)，而17q23的拷貝區(qū)在肺癌、腦瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤上顯著增加且其擴(kuò)增與多種腫瘤的發(fā)展、惡化和預(yù)后有關(guān)[5-7,11-14]。目前，在該區(qū)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與腫瘤相關(guān)的因子，如BRIP1、TRIM 37、和RPS6KB 1等[15-17]。Yi等[13]認(rèn)為，17q23的拷貝區(qū)在肺癌上顯著增加，實(shí)驗(yàn)表明在肺癌中，PRR11的表達(dá)顯著增加。

本實(shí)驗(yàn)研究了PRR11在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，并在幾種胰腺癌細(xì)胞中檢測(cè)PRR11的表達(dá)，選擇PRR11表達(dá)最顯著的SW1990細(xì)胞進(jìn)行研究和檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在67例胰腺癌患者中，PRR11在胰腺癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織，免疫組化的結(jié)果顯示，PRR11在細(xì)胞質(zhì)中呈棕色陽(yáng)性表達(dá)，這與Tan等[18]的臨床研究結(jié)果相符合。通過對(duì)PRR11敲減處理，在SW1990胰腺癌細(xì)胞上進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示PRR11敲減后，PRR11在SW1990細(xì)胞的表達(dá)顯著降低。此外，si-PRR11組的促凋亡基因Caspase 3的表達(dá)顯著上調(diào)，BCL2顯著降低，表明敲減PRR11基因可能促進(jìn)SW1990胰腺癌細(xì)胞的凋亡。與對(duì)照組比較，si-PRR11組SW1990細(xì)胞的遷移能力顯著降低，提示敲減PRR11后可降低SW1990細(xì)胞的遷移。

綜上所述，PRR11是影響胰腺癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵基因之一，PRR11的研究將為胰腺癌的致病機(jī)制和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。但是胰腺癌的發(fā)生是個(gè)非常復(fù)雜的生物過程，其診斷和治療還有待進(jìn)一步探究。